非放射性地高辛標記DNA探針法

實驗概要

掌握非放射性地高辛標記DNA探針法。  

實驗原理

以往人們是用放射性同位素來標記探針DNA。近年來，非同位素標記方法發展很快，已有取代同位素標記法的趨勢。地高辛配基隨機標記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標記方法（Saiki等，1985）。其原理是：用化學方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補DNA，化學修飾過的dUTP同時摻入到標記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛單抗與標記探針DNA中的Dig-dUTP結合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉變成深棕色或藍色的化合物。或用X-film放射自顯影。  地高辛標記DNA的基本過程是：制備DNA探針，標記探針，檢測樣本。其中關鍵步驟是要得到高靈敏度、高特異性的探針。
標記：采用隨機引物標記方法，可標記少至10ng，多至3ug的DNA。能在新合成的DNA鏈每20-25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應時間約為1h。
雜交：按標準雜交方法進行。可以采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復使用。
  免疫學檢測：封阻后，檢測反應的第一步，抗體結合物與標記DNA結合，出現雜交的半抗原-標記DNA，顯色反應起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和硝基蘭四唑NBT，在幾分鐘內便開始出現藍色，顯色反應的過程持續3天。典型的例子是在24小時后終止顯色反應。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。
  應用：地高辛配基標記DNA探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源DNA，能檢測1μg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標記系統比較，此試劑盒能快速得到實驗結果（從DNA的標記和雜交至見到檢測結果24h內能完成），而且消除了放射性的不安全問題。試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術（包括DNA-印跡轉移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標記和放射自顯影術。

主要試劑

1. DNA稀釋緩沖液有兩管，每管1ml：

  [成分為：Tris-HCl(10mM)，EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)]內含鮭魚精DNA（50μg/ml）。

2. 六聚核苷酸混合物

3. 標記用混合底物：此管內有50μl，濃度的dNTP標記用混合底物，含dATP（1mL）dCTP(1mM)，dGTP(1mM)，dTTP(0.65mM)和Dig-
     dUTP(0.35mM)，pH6.5(20℃)。

4. DNA聚合酶Ⅰ大片段（標記級）：此管內有25μl，DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2 U/μl　。

5. （Dig）AP結合物：此管內有200μl，多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結合有堿性磷酸酶750 U/ml。

6. NBT有兩管，每管1.25ml，溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基藍四唑鹽溶液（75mg/ml）。

7. X-磷酸鹽，兩管，每管0.9ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

8. 封阻試劑，兩瓶，每瓶有50g粉劑。

需配制的溶液：

EDTA(0.2M),pH8.0(20℃)  
LiCl(4M)   
70%(V/V)乙醇
Tris-HCl(10mM) 
EDTA(1mM)，pH8.0(20℃) 
10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽 
10%(V/V)SDS  
0.3M檸檬酸三鈉         
3M NaCl      
20×SSC
pH7.0,Tris-HCl(100mM)  
NaCl(150mM)  
pH7.5Tris–HCl(100mM)         
MgCl₂(50mM)pH9.5(20℃) 
NaCl(100mM)

實驗步驟

1. 取10μl待測DNA，于1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。

2. 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號, 拍照, 記錄電泳結果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。

3. 雜交用膠的制備
   (1) 將凝膠浸沒入30mL 0.25M HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
   (2) 用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
   (3) 將凝膠浸沒入30mL　0.4M NaOH中30min, 使它被中和。

4. 準備DNA從凝膠向膜轉移的平臺
   (1) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標記。
   (2) 另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約450px)足以達到轉移液盒子的底部。
   (3) 準備10 X SSC 轉移液。
   (4) 將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉移液中。

5. 安裝毛細管轉移裝置
   (1) 將長的濾紙放在轉移平臺的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。
   (2) 將8 0mL轉移液倒入轉移盒內，并濕潤濾紙。
   (3) 將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
   (4) 用保鮮紙封住凝膠四邊。
   (5) 將浸濕的轉移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
   (6) 將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物。
   (7) 轉移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉移液干枯。

6. 已轉移的DNA與膜交聯
   (1) 將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
   (2) 將膜置于UV 交聯器（crosslinker）中，在紫外光下自動交聯3min。
   (3) 用蒸餾水短暫的漂洗已交聯的膜，空氣中干燥。
此膜可在4℃長期保存。

7. 標記DNA探針　每次標準的反應可標記10ng至3ug線性的DNA，也可標記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應增加。

   (1) DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

   (2) 取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上,加下列及試劑：

　　新鮮變性的DNA 　　　　　　　　　  1-3μg

　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　   2μl　

　　dNTP標記用混合底物 　　　　　　　 2μl　

　　加無菌重蒸水至　　　　　　　　　   19μl　

　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow 5U/ul）1μl　

   (3) 在37℃保溫至少60min，可到20h。

   (4) 煮沸5min，終止反應。

   (5) 15000rpm離心30s，置于冰上待用。

8. 預雜交　按2500px²膜用20-40ml預雜交溶液，預雜交時使溶液處于流動狀態。

　　預雜交液組成：5×SSC

　　0.5%（W/V）封閉試劑：1%聚蔗糖（Ficool 400），1%PVP，1%BSA。

　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

　　0.02%（W/V）SDS

　　膜放入塑料袋，灌入預雜交液，排除氣體后密封，在65℃預雜交過夜。

9. 雜交　按2500px²膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。

　　雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）

　　                         5%（W/V）封閉試劑

　　                         5×SSC

　　                         0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

　　                        0.02%(W/V)SDS

　　                        新變性標記DNA（150ng/ml）

雜交液取代預雜交液，替換時膜不能干，成功地替換應是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。

10. 洗膜　　按2500px²膜用250ml洗膜液計算。

   (1) 在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

   (2) 在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

   (3) 在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

11. 免疫測定

   (1) 配制溶液

　　緩沖液1：Tris-HCl(100mM);NaCl(150mM)pH7.5(20℃）

　　緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應預早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。

　　緩沖液3：Tris-HCI(100mM);NaCI(100mM);MgCI2(500mM)pH9.5(20℃)。

　　緩沖液4：Tris-HCl(10mM);EDTA(1mM);pH8.0(20℃)

　　顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μl　NBT溶液（管9）和35μl　 X-磷酸鹽緩沖液。

  (2) 顯色過程

　     A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。

　     B．在100ml緩沖2中保溫30min。

　     C．再用緩沖液1短暫洗滌。

　     D. 用緩沖液1稀釋的抗體結合物至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12h。

　     E. 膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30min。

　     F. 用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結合的抗體結合物,15min,2次。

　     G. 膜在緩沖液3中平衡2min。

      H. 在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內密封或放入合適的盒子內,幾分鐘內開始出現顏色,一般顯色反應在1天后全部完成。當顏色顯現時，不可振蕩或攪拌。

　     I．當要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應。

      J．攝相。

說明：上述各反應均在室溫下進行，除了顯色反應外，均需振蕩或攪拌。

注意事項

1. DNA不能有效地被標記時考慮

   (1) 用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。

   (2) 標記反應的保溫時間延長（增至20h）。

   (3) DNA變性或許不完全，這時對大片段DNA特別重要。

2. 不能達到預期的靈敏度時考慮

   (1) DNA標記率。

   (2) 增加標記DNA的濃度或增加雜交時間。

   (3) 顯色反應的時間可延長至3天。

3. 若顯色時背景過深，可采取

   (1) 在雜交溶液中減少標記DNA量。

   (2) 增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。

   (3) 某些類型的尼龍膜可能產生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。

   (4) 在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。