非標記蛋白質的磷酸化作用分析實驗

蛋白質樣品

釩酸鈉 封阻液 TN TNA Tris·Cl 疊氮鈉 印度墨汁染色液 TBS

吸水紙 水浴鍋

1.  用等體積的2×SDS上樣緩沖液溶解培養細胞，組織或裂解物，煮沸5 min。

2.  在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳樣品，用含100 μmol/l 釩酸鈉的轉移緩沖液將蛋白質轉移至適用于免疫印跡分析的膜上。

3.  膜在室溫下用30~50 ml 封阻液封閉30 min 以上。

4.  在帶蓋的塑料容器內，膜與30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗體溶液室溫溫育60~120 min，間或搖動。

5.  取出膜，用吸水紙吸干多余液體，在一個新的塑料容器內，用TBSA溶液洗膜 2次，每次10 min；50 ml NP-40洗膜液洗膜2次，每次10 min；再用50 ml TBSA洗膜2次，每次5 min，棄洗液。

6.  用30~50 ml 含0.5 μCi/ml ¹²⁵I 標記蛋白A與膜在室溫下溫育60 min，間或搖動。

7.  移出膜，用吸水紙吸干多余液體，同步驟5洗膜。 

8.  如果需要，用30~50 ml 墨汁染色液染膜5~10 min，直到有可見蛋白帶，充分洗膜除掉多余的墨計。

9.  用吸水紙吸干多余液體，用塑料包裝膜包好，加上放射性或熒光的位置標記后，用經預閃光致敏的X光片和增感屏，自顯影18 h至10天。