革命性的超分辨率顯微新技術研究進展

發布時間：2021-01-01 01:20 原文鏈接：革命性的超分辨率顯微新技術研究進展

【前言】熒光納米檢測（Fluorescence nanoscopy）技術已經被擴展用于結構生物學。接下來介紹超分辨率顯微新技術的研究進展。

多年前，超分辨率成像就已經成為結構生物學中的一種主要技術，增進科學家們對大分子復合物組織的理解。

2013年，科學家們借助于低溫電子顯微鏡（cryo-EM）的粒度平均方法（particle-averaging methods），利用單分子定位顯微鏡（SMLM）的熒光標記蛋白定位，分析細胞核孔復合物（NPC）的結構（Science 341,655-658,2013）。這項研究的基礎在于已知的孔隙對稱性。盡管在這種情況下并不嚴格需要，但如果沒有之前的基于熒光結構的先驗知識，研究也不能順利開展。時至今日這一研究領域的技術進步已經指出了熒光在結構生物學研究中的越來越多的應用。

首先，超分辨率方法在分辨率方面正在提高，已經達到了分子級別。在馬普生物物理化學研究所諾獎得主Stefan Hell研究小組提出的MinFlux新方法中，首次允許利用光學手段區分彼此間相隔幾納米的分子，也就是說利用MINFLUX可以實現1納米的分辨率，這是單個分子的直徑---在熒光顯微鏡中可能實現的最終分辨率限制（Science 355,606-612,2017，具體見后）。還有Vahid Sandogdhar研究組報道了低溫下利用SMLM實現的蛋白質? 埃米(Angstrom)分辨率（Nat.Methods 14,141-144，2017）。

其次，基于CRISPR的基因編輯技術能讓熒光標記所有內源蛋白拷貝成為可能。再加上更明亮的探針和更小的親和試劑，這將有助于實現基于熒光的結構作圖所需的更完整標記。

同時這也需要改進熒光數據重建結構的分析方法。不需要結構模板并且專門用于熒光數據的特殊方法可能更有效。

科學家們預測，超分辨率熒光顯微鏡將繼續幫助研究人員深入了解生物結構，未來也許可以發展到分子級別。

MINFLUX新熒光顯微技術

物理學家Ernst Abbe在1873年提出光學顯微鏡的分辨率限制在光的波長的一半，大約是200納米。100多年后，這種阿貝限制（Abbe limit）仍然是有效的。然而馬普生物物理化學研究所諾獎得主Stefan Hell第一次證實這種限制能夠被STED顯微鏡克服：他1994年想出這種方法，在5年后，實驗性地構建出這種STED顯微鏡。

與PALM/STORM一樣，MINFLUX隨機地開啟和關閉單個分子。然而，與此同時，它們的精確位置可通過類似于STED中的圓環形激光束加以確定。不同于STED的是，這種圓環形激光束在MINFLUX中激發熒光產生。如果這個分子位于圓環表面上的話，它將發出熒光；如果它正好位于昏暗的圓環中心的話，它不會發光熒光，但是人們能夠發現它的精確位置。

除了實現分子分辨率外，將STED和PALM/STORM結合在一起也提供另一種主要優勢：Hell聲稱，“相比而言，MINFLUX更加快速。鑒于它利用一種圓環形激光束工作，相比于PALM/STORM而言，在獲得每個分子最終的分辨率上，它需要更低的光信號或者說更少的熒光光子。”人們已經能夠利用STED實時地記錄活細胞內部的影像。但是如今，在一種時間分辨率提高100倍的情形下追蹤細胞中的分子運動是可能的。他首次成功地利用MINFLUX以一種前所未有的時空分辨率拍攝出活的大腸桿菌中分子運動的影像。研究人員深信在未來，能夠研究活細胞中極其快速發生的變化，比如細胞納米機器的運動，或者蛋白折疊。

參考文獻：

Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging

Cryogenic optical localization provides 3D protein structure data with Angstrom resolution

Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes