預處理法提取土壤DNA

預處理法提取土壤DNA

實驗試劑

1.      TENP緩沖液：50 mM Tris，20 mM EDTA，100mM NaCl，1% PVPP，pH10

2.      PBS緩沖液：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH7.4

3.      DNA提取緩沖液： TrisBase 0.1M, EDTA 0.1M, NaCl 1.5M, CTAB 1%

4.      溶菌酶（10 mg/ml）

5.      蛋白酶K(20 mg/ml)

6.      SDS (20%，m/V)

7.      氯仿：異戊醇（24：1）

實驗步驟

1.        取1 g土壤，加入6 ml TENP緩沖液，渦旋震蕩混勻10 min，12000 rpm離心5 min，棄上清，重復洗滌3次；

2.        土壤沉淀再加入6 ml PBS緩沖液，洗滌一次，棄上清；

3.        加入37 ℃預熱的13.5 ml DNA提取緩沖液，再加入100 μl溶菌酶，50 μl蛋白酶K，水平搖床上225 rpm，37 ℃搖動30 min；

4.        再加入1.5 ml SDS，65 ℃水浴2 h，其間間隔20 min混勻一次；

5.        6000 g室溫離心15 min，上清液轉入新的離心管中；

6.        分別加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1），混勻，6000 g離心15 min，取上清，重復抽提一次；加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置1 h；

7.        15000 rpm室溫離心20 min，沉淀用70%乙醇清洗2次，風干；

8.        用100 μl無菌去離子水重新懸浮。