顏寧團隊首次解析被發現20多年的鈉離子通道蛋白

　　NaChBac是第一個被表征為電壓門控的Na +（Nav）通道，已經成為研究Nav通道結構與功能關系的原核原型。在近二十年前發現的NaChBac的結構尚未確定。

　　2020年6月8日，顏寧團隊在PNAS 在線發表題為“Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc”的研究論文，該研究介紹在洗滌劑膠束和納米圓盤中NaChBac的單粒子冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）分析。在兩種條件下，NaChBac的構象與潛在滅活的NavAb的構象幾乎相同。確定納米光盤中NaChBac的結構使研究人員能夠檢查脂質雙層中Nav通道的門控修飾劑毒素（GMT）。

　　為了研究哺乳動物Nav通道中的GMT，該研究生成了一個嵌合體，其中Nav1.7的第二個電壓感測域中S3和S4區段的細胞外片段替換了NaChBac中的相應序列。此解決方案可實現毒素對接的可視化。因此，NaChBac可以用作膜環境中GMT與Nav通道之間相互作用的結構研究的便捷替代品。

　　另外，2020年5月13日，顏寧等團隊在Nature 在線發表題為”Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1“的研究論文，該研究介紹了人類ACAT1的冷凍電子顯微鏡結構。每個protomer都由九個跨膜段組成，這些段包圍了一個胞質通道和一個在預計的催化位點會聚的跨膜通道。結構指導的突變分析的證據表明，酰基輔酶A通過細胞質通道進入活性位點，而膽固醇可能從側面通過跨膜通道進入。這種結構和生化特征有助于合理化ACAT1對不飽和酰基鏈的偏好，并提供對MBOAT家族中酶催化機制的見解。

　　2020年5月13日，顏寧等團隊在Nature 在線發表題為”Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1“的研究論文，該研究介紹了人類DGAT1的冷凍電子顯微鏡結構。每個DGAT1都有9個跨膜螺旋，其中8個形成保守的結構折疊，將其命名為MBOAT折疊。DGAT1中的MBOAT折疊在膜中形成一個中空腔室，該腔室包圍著高度保守的催化殘留物。該腔室有兩個底物，脂肪酰基輔酶A和二酰基甘油的單獨入口。 DGAT1可以同型二聚體或同型四聚體形式存在，兩種形式具有相似的酶活性。DGAT1的N末端與鄰近的protomer相互作用，而這些相互作用是酶促活性所必需的。

　　電壓門控鈉（Nav）通道通過響應可激發細胞中跨膜電場（膜電位）的變化，選擇性地將Na +滲透到整個細胞膜上來啟動和傳播動作電位。在人類中，Nav通道有9個亞型，即Nav1.1至1.9，其在電子信號中的核心作用反映在與Nav通道異常功能相關的各種疾病中。迄今為止，已在人類Nav通道中鑒定出1,000多種突變，這些突變與癲癇，心律不齊，疼痛綜合征，自閉癥譜系障礙和其他疾病有關。Nav通道的結構和功能機制的闡明將有助于對基礎生物學的理解，并有助于潛在的臨床應用。

　　真核Nav通道由成孔的α亞基和輔助亞基組成。α亞基由一條多肽鏈構成，該多肽鏈折疊成六個跨膜段（S1到S6）的四個重復域（I到IV）。來自每個部分的S5和S6片段構成通道的孔區域，其側翼是由S1至S4形成的四個電壓感測域（VSD）。VSD是一個相對獨立的結構實體，為依賴電壓的通道（Nav，Kv和Cav通道）和酶中的電壓傳感提供了分子基礎。

　　由于冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）的技術進步，能夠分辨來自不同物種的Cav和Nav通道的原子結構，并具有獨特的輔助亞基，動物毒素和FDA批準的藥物。Nav1.7的突變與各種疼痛疾病有關，例如對疼痛漠不關心或極端疼痛綜合癥。在存在β1和β2亞基的情況下，確定了結合孔阻斷劑（Protoxin II與河豚毒素；Huwentoxin IV [HWTX-IV]與saxitoxin）及結合的狼蛛門控修飾劑毒素（GMT）的人Nav1.7的結構，總分辨率為3.2?。毒素的較差分辨率可能是由于去污劑膠束中與膜的相互作用喪失所致。據報道，完整的膜可促進這些毒素的作用。

　　來自嗜堿性芽孢桿菌的NaChBac是第一個被鑒定的原核Nav通道。隨后對該家族的更多直系同源物進行了表征。與真核對應物相反，細菌Nav通道是6-TM亞基的同源四聚體。以NavAb和NavRh為例的細菌Nav通道已被用作結構-功能關系研究的重要模型系統。盡管在二十年前被發現，原型NaChBac的結構仍然未知。

　　在原核和真核Nav通道之間，所表征的GMT結合位點不保守。在這些嵌合體中，VSDs的細胞外半部分被真核對應物的相應序列取代。這些研究為VMT上GMT的功能提供了重要的見識，并促進了在不同構象中Nav通道的結構闡明。

　　最常用的支架蛋白是NavAb。但是，NavAb在昆蟲細胞中的過表達和純化既昂貴又緩慢。可替代地，NavRh不能被記錄在任何測試的異源系統中。因此，該研究專注于NaChBac。通過克服適用于冷凍EM分析的重組NaChBac的技術挑戰，該研究能夠解決洗滌劑膠束和納米圓盤中NaChBac的結構。產生了能與HWTX-IV結合的NaChBac嵌合體。在納米圓盤中，其單獨結構以及與HWTX-IV的結構分別確定為3.5和3.2?分辨率。

　　為了研究哺乳動物Nav通道中的GMT，該研究生成了一個嵌合體，其中Nav1.7的第二個電壓感測域中S3和S4區段的細胞外片段替換了NaChBac中的相應序列。單獨和與HuwenToxin IV（HWTX-IV）配合使用的納米盤嵌入嵌合體的Cryo-EM結構分別確定為3.5和3.2?分辨率。與HWTX-IV結合的人Nav1.7的結構相比，該結構的總分辨率為3.2?，毒素的局部分辨率已從約6?提升到了約4?。此解決方案可實現毒素對接的可視化。因此，NaChBac可以用作膜環境中GMT與Nav通道之間相互作用的結構研究的便捷替代品。

　　參考消息：

　　https://www.pnas.org/content/early/2020/06/05/1922903117