食用油中3氯丙二醇測定新法

食用植物油中普遍存在3-氯丙二醇（3-MCPD），該物質對人體健康的危害性至今尚無定論。然而，對它的鑒定分析已成為食品安全的熱點之一。本文介紹了將大體積進樣（LVI）與二維氣相-飛行時間質譜（GC×GC-TOF-MS）相結合的方式，對3-MCPD進行定量分析，并取得了良好的效果。

人們或許對此還記憶憂新：2002年，一個叫丙烯酰胺的名字引起了人們的不安和恐慌，晨讀時咖啡和烤面包的芳香已不再美妙，反倒勾起了恐懼。而今，丙烯酰胺會改變動物的遺傳并引發腫瘤已不再是新聞。和它類似的還有3-氯丙二醇（3-MCPD），盡管少了一些媒體的炒作，不如丙烯酰胺那樣引人關注，白鼠試驗卻已證實了高劑量的3-MCPD會引發腎腫瘤。

丙烯酰胺和3-MCPD對人體健康的威脅有多大？由于目前仍有很多疑點沒有得到充分的解答，因此至今尚無定論。但有一點是肯定的：這兩種物質都不是天然存在于食品中，而是在生產或深加工過程中產生的。

圖1.  25μl棕櫚油提取液的LVI-GC-TOF-MS總離子流圖。3-MCPD衍生物與基質成分的共洗脫使得目標峰難以分辨。

3-MCPD的產生

植物油的加工要經過一道工藝，稱作精煉。傳統的精煉分為4個步驟，是一些化學和物理的過程。在這些過程中，食用植物油及其油脂被加熱到250℃，以除去一些會產生不良味道、氣味和色澤的雜質，這樣的植物油才能食用。然而，該工藝也是產生3-MCPD脂肪酸酯的主要途徑：在高溫過程中，一些油脂成分以及各種脂肪酸和氯離子發生反應，從而產生3-MCPD脂肪酸酯。

傳統分析法的不足

根據動物試驗結果，歐盟（EU）規定3-MCPD的限量為20μg/kg，歐盟專家則認為3-MCPD的日攝入量為2μg/kg是可以接受的。低限量要求對3-MCPD脂肪酸酯檢測的靈敏度提出了挑戰。氣質聯用（GC/MS）是目前最常用的檢測3-MCPD的手段，然而GC/MS法存在一個嚴重的不足：大量的基質成分會同目標化合物一同被洗脫下來，給分析造成很大干擾。

通常鑒定食用油中3-MCPD脂肪酸酯采用的方式是將油或油脂水解后測定3-MCPD的總量，采用氘代內標3-MCPD-d5或其酯定量。樣品在GC/MS分析前要進行各種前處理：水解、除脂肪酸（脂肪酸甲酯形式）、游離3-MCPD的鹽析提取、苯基硼酸衍生處理以及溶劑的蒸發濃縮。這是一個耗時又費工的過程，與此同時，操作者還要小心避免因堿性水解或鹽析產生負面結果的可能。堿性水解步驟會導致3-MCPD的分解，而鹽析則會促成3-MCPD的生成，從而導致平衡的失調。

LVI結合二維GC分析

實踐證明，大體積進樣（LVI）可以明顯提高分析方法的靈敏度。這是由于不分流進樣模式只能進1~2μl的樣品，而LVI的進樣量可高達100μl以上。此外，采用LVI還可以省去蒸發濃縮以及鹽析步驟，從而縮短樣品前處理的時間。而峰容量過大和大量的背景雜質問題，則可以通過全二維氣相色譜（GC×GC）來解決。為了保證二維色譜圖中目標峰鑒定的可靠性和定量的精確性，所用質譜的采集頻率不能低于100全譜圖/s。目前通常采用可保證全譜圖高速采集頻率的飛行時間質譜（TOF-MS）。

本文著重探討LVI與GC×GC-TOF-MS聯用分析食用油中3-MCPD-脂肪酸酯的效率、可靠性和靈敏度。

圖2.  25μl棕櫚油提取液的GC×GC-TOFMS總離子流二維輪廓圖。3-MCPD衍生物（紅圈內）與其他基質成分清晰分開。

實驗儀器

Leco公司的Pegasus?4D?GC×GC-TOF-MS、四射噴流加熱調制器（Leco）、全二維氣相色譜柱箱（Leco）、帶有燒結玻璃襯管的OPTIC-3-程序升溫汽化（PTV）進樣器（Atas GL）。4D GC×GC-TOFMS由Leco的數據采集和處理軟件Chroma-TOF進行控制和解析，PTV進樣器由Atas GL的Evolution軟件操控。第一維分離采用的色譜柱為瓦里安公司的VF-1ms柱（30m×0.25mm×0.25μm）；第二維分離則是采用VF-17ms柱（1m×0.1mm×0.2μm）。

大體積不分流進樣

實驗采用大體積不分流進樣，進25μl樣品（棕櫚油提取物）后進行溶劑排空（40℃，20s，排空流量50ml/min），隨后關閉分流閥，以5℃/s的速度開始進樣口程序升溫，加熱至300℃。一維分離的升溫程序為：40℃（1min），以6℃/min速度升溫至90℃，再以20℃/min的速度升溫至280℃（30min）。二維分離的爐溫比一維分別高出5℃，即：45℃（1min），以6℃/min升溫至195℃，再以20℃/min速度升溫至285℃（30min）。調制周期為4s；TOF-MS采集速度為200幀/秒；質量數范圍為50~500m/z；載氣為氦氣；流速為1ml/min。

樣品前處理

將100mg均質的棕櫚油樣品稱入帶螺紋口的離心管中，加入500μl甲基叔丁基醚/乙酸乙酯混合液（8:2v/v）、250μl內標（3-MCPDd5，20μg/ml，溶于甲基叔丁基醚）及1ml NaOCH3溶液（0.5M）。1min后加入3ml異己烷，100μl冰醋酸及3ml氯化鈉溶液（200g/L），LVI模式則不使用氯化鈉溶液。振蕩混合離心后，用移液管移去上層液體，余下水層再用異己烷提取一次，移去上層液體。在水相中加入250μl衍生試劑（5g苯基硼酸溶于19ml丙酮及1ml水），加熱至80℃，持續20min后，放至室溫下冷卻。3-MCPD的苯基硼酸鹽衍生物用3ml正己烷提取。提取液經蒸發濃縮后（LVI模式可省略該步驟），將正己烷濃縮液注入GC×GC-TOF-MS系統。

實驗結果

為了將GC×GC-TOF-MS方法和文獻中的一維方法進行對比，實驗人員取一份棕櫚油樣品進行GC-TOF-MS分析。圖1為25μl樣品的LVI-GC-TOF-MS總離子流圖，由此可以清楚地看到：3-MCPD-衍生物與基質成分共同被洗脫出來，難以分辨目標峰。相反，在二維方法的總離子流輪廓圖（如圖2所示）中，3-MCPD-衍生物與其他基質成分清晰地分開了。定量則采用內標法，在樣品提取液中加入已知量的3-MCPDd5內標，制作等量同位素內標的目標物濃度梯度曲線進行定量。

上述定量法的缺點是：無論一維還是二維方法，3-MCPD和3-MCPD-d5都會同時洗脫出來，混雜的譜圖使得3-MCPD-衍生物無法被準確鑒定出來。但是，TOF-MS具備譜圖解卷積（TSD）功能，這意味著：盡管3-MCPD和3-MCPD-d5同時被洗脫出來，目標物的純譜圖卻可以被分離出來，人們可以對這兩種化合物進行準確的定量。為驗證該方法的定量限（LOQ）和檢測限（LOD），將樣品提取液進樣10次，檢測結果如圖表所示，濃度平均值為0.47μg/g，信噪比為1767。兩種化合物的LOQ及LOD的計算如下：

LOD=（3/1767）×0.47=0.00080μg/g

LOQ=（10/1767）×0.47=0.00267μg/g

小結

實驗測得3-MCPD的濃度標準偏差為2.7%。另外，檢測儀器的穩定性也至關重要，分析此類樣品時，一些儀器會遇到相關問題，如四級桿質譜的檢測器會受到分析次數的限制，最多完成10次檢測后，離子源就需要進行清潔和維護，以保證結果的重現性。而應用Pegasus系統則能避免這類問題的出現。為驗證它的穩定性，研究人員根據上述方法做了100次平行測試，最終得出結論：100次檢測的結果相似，儀器的穩定性并未受到影響。

大體積進樣

作為傳統進樣法的替代，大體積進樣（LVI）具備以下優點：提高了分析的靈敏度；操作者可省去蒸發濃縮及鹽析步驟。需要注意的是，LVI在分析揮發性化合物時要進行優化設置。