食蟹猴胚胎體外培養模型揭示靈長類早期神經胚發育特征

出生缺陷影響健康。有數據顯示，當前已知的出生缺陷病種超過8000種，其中神經管畸形是常見的一類出生缺陷。出生缺陷的發生與早期胚胎發育異常直接相關。因此，研究早期胚胎發育過程、探究發育機理，是揭示病理性胚胎發生機制，提升相關疾病診療效率，從根源上提高健康水平的重要前提。

　　人早期胚胎發育起始于受精卵（胚胎期第0天；day post-fertilization 0；d.p.f. 0）。受精卵經過數次卵裂形成囊胚，囊胚于d.p.f. 7左右種植入母體子宮并進一步發育，于d.p.f. 14啟動原腸運動。原腸運動是早期胚胎發育過程中的重要事件。在此過程中，胚胎細胞發生大規模分化、遷移和重排，并形成外、中、內三胚層和體軸。外胚層于d.p.f. 20左右進一步發育形成位于中間的神經板（也稱神經外胚層）、位于兩側的表皮外胚層和位于兩者之間的神經板邊緣。神經板彎曲、折疊、增厚并進一步閉合，形成神經管。閉合的神經管沿胚胎背腹軸分化出不同的神經祖細胞。神經管形成的過程稱為神經胚形成。中、內胚層進一步發育出體節、心臟、腸管等早期器官的原基，胚胎自此進入更加復雜的器官發育階段。由于人早期胚胎樣品極難獲取，以上事件在人類胚胎中無法被直接探究和揭示。

　　胚胎體外培養技術為探索人類胚胎早期發育提供了有力武器。借此，人d.p.f. 14之前的發育事件已被初步揭示。而人類胚胎體外研究存在必須在d.p.f. 14終止的倫理限制。因此，體外培養的人類胚胎不能被用于研究d.p.f. 14之后的原腸運動和早期神經胚發育等事件。非人靈長類與人類在進化上和發育生物學特征上高度相似，是研究人早期胚胎發育的理想模型。因此，搭建非人靈長類胚胎體外培養體系，揭示非人靈長類胚胎發育特征，將提升科學家對包括人類在內的靈長類早期胚胎發育及相關疾病的認知。1995年，澳大利亞科學家將絨猴的囊胚體外培養至d.p.f. 11，用于研究靈長類動物胚胎植入后發育。2019年，中國科學院動物研究所王紅梅團隊及國內外同行將食蟹猴胚胎體外培養至d.p.f. 20，探討了靈長類早期原腸運動特征。那么，靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經胚發育有哪些特征？是否可以延長食蟹猴胚胎體外發育歷程，以進一步剖析靈長類胚胎發育特征？這些問題是發育生物學領域前沿熱點問題。

　　為了回答上述科學問題，研究建立了一個可支持食蟹猴胚胎體外發育至受精后25天的3D長時程培養體系，并基于該體系探析了靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經發育過程中的核心事件和譜系特征。研究比較了人類和非人靈長類胚胎2D（2D Ibidi μ-plates和2D coated with Matrigel，Ibidi-2D和M-2D）和3D（3D low-adhesion 96-well with Matrigel，M-3D）體外培養體系，對不同體系中胚胎的大小和存活率進行評估。研究顯示，2D和3D體系都能支持胚胎發育到d.p.f. 20。在2D體系下，胚胎由于胚外組織發育旺盛而迅速增大，但內部的胚體發育并不好。而在3D體系下，胚胎的胚外組織生長受限，但胚體結構顯著發育。這些特征提示2D體系優先支持胚外組織生長，而胚外組織的過度生長可能限制了胚體本身的發育。為了保證胚體的發育，研究繼續優化3D體系。已報道的人類胚胎M-3D體系需要在d.p.f. 9-14的培養基中連續添加Matrigel，以模擬人類胚胎植入后環境。鑒于食蟹猴胚胎植入子宮比人類胚胎淺表，因此研究僅在d.p.f. 10-12的培養基中加入Matrigel。優化后的體系能支持33.7%（n = 91）的食蟹猴胚胎發育到d.p.f. 25。該體系被命名為3D長時程培養體系（prolonged in vitro culture，pIVC；圖1）。

　　為了探索靈長類早期神經胚發育過程，研究對神經系統發育關鍵調控因子進行鑒定。d.p.f. 20-22胚胎的胚體背側中部可檢測到OTX2⁺/OCT4⁺或OTX2⁺/SOX2⁺的細胞，提示OTX2的表達與外胚層細胞分化密切相關。PAX3和PAX6表達于d.p.f. 22-25的外胚層細胞，表明此時神經外胚層的特化。在d.p.f. 24-25的胚胎中可檢測到神經外胚層閉合的區域，提示神經管形成。此外，OTX2、PAX8和NKX2.2陽性細胞分布于神經管的前部、中部和后部，提示此時的胚胎已有前腦、中腦和后腦/脊髓的區域化。結合神經管的形態特征，研究發現胚胎前部神經管未閉合，后部神經管已閉合。未閉合和已閉合的神經管均表達N-CAD，而不表達E-CAD，表明胚胎在神經管閉合之前已完成E-CAD向N-CAD的轉變。這些pIVC胚胎的神經管形態和分子表達特征與體內相同發育階段的胚胎相似（圖2）。伴隨神經外胚層的發育，表皮和神經板邊緣的發育同步進行。熒光染色結果顯示，d.p.f. 22-25的胚胎已分化出TFAP2A⁺/E-CAD⁺的表皮細胞。在未閉合的神經板兩側和閉合的神經管兩側存在PAX3⁺/SOX9⁺/SLUG⁺細胞，標志著神經板邊緣和其分化的神經嵴細胞的發育。

　　為了剖析閉合的神經管細胞是否具有沿背腹軸不對稱分化的模式，研究對d.p.f. 25胚胎的神經管進行鑒定。研究發現在閉合的神經管背側存在PAX3陽性細胞、腹側存在FOXA2和NKX6.1陽性細胞，表明神經管頂板（roof plate）和底板（floor plate）的特化。此外，β-tubulin Ⅲ⁺/OLIG2⁺細胞標志著運動神經元祖細胞（progenitors of motor neurons）的特化；NKX2.2⁺/FOXA2⁺細胞標志著腹側中間神經元祖細胞（progenitors of ventral interneuron 3）的特化。與閉合的神經管相比，OLIG2和NKX2.2未能在未閉合的神經管中檢測到。這些分子表達特征與體內對應階段胚胎的特征一致，表明pIVC胚胎可重現神經管沿背腹軸區域化發育的模式（圖3）。

　　除外胚層和神經管發育外，研究還檢測了pIVC胚胎中原始生殖細胞（primordial germ cells）以及中、內胚層的發育特征。熒光染色結果顯示，SOX17⁺/TFAP2C⁺/BLIMP1⁺細胞可在d.p.f. 22-24的胚胎后部腹側被檢測到，提示pIVC胚胎可發育出原始生殖細胞樣細胞。在胚胎腹側的位置還可檢測到T⁺/CDX2⁺/OCT4^+/Low或T⁺/TBX6⁺/SOX2^-細胞，表明pIVC胚胎可發育出原條及其分化產物。此外，T⁺/TBX6⁺/SOX2⁺細胞的出現提示胚體存在類神經中胚層祖細胞（neuromesodermal progenitor）或前體節中胚層細胞（presomitic mesoderm）的特化。此外，研究可在pIVC胚胎的單細胞轉錄組數據中檢測到MYL7、NKX2-5、HAND1和GATA4共表達的細胞，提示pIVC胚胎或存在心臟中胚層樣細胞。單細胞多組學和熒光染色結果提示pIVC胚胎中可檢測到OTX2⁺/FOXA2⁺/SOX17⁺細胞，表明胚胎已分化出定型內胚層（definitive endoderm）和卵黃囊（yolk sac）。與相同發育階段的體內正常胚胎相比，pIVC胚胎的這些分子表達特征與正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重現原腸運動中晚期階段中胚層和內胚層的發育。

　　研究進一步利用單細胞多組學測序技術（單細胞轉錄組、DNA甲基化和染色質可及性測序，scChaRM-seq），對9個pIVC胚胎的3,850個單細胞的轉錄組和1,862個單細胞的DNA甲基化和染色質可及性進行測序和分析。結果提示，與本團隊2022年在《自然》（Nature）報道的相同發育階段的食蟹猴胚胎單細胞轉錄組數據庫相比，pIVC胚胎可重現體內正常胚胎的轉錄組特征。DNA甲基化分析提示，pIVC胚胎各種細胞類型的基因均發生了甲基化，且胚胎組織的DNA甲基化水平（~75%）高于胚外組織（~50%），這與已報道的小鼠和人類胚胎特征相似。

　　綜上所述，本研究建立了可支持食蟹猴胚胎體外發育至d.p.f. 25的3D pIVC體系，并基于該體系揭示了靈長類胚胎中晚期原腸運動至早期神經胚發育階段胚胎的形態、細胞組分、轉錄組、DNA甲基化和染色質可及性等特征。該成果為闡釋人類早期胚胎發育機制、為早期胚胎發育異常相關疾病的病理研究提供了技術平臺。

　　5月11日，相關研究成果作為封面文章，以Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture為題，發表在《細胞》（Cell）上。該研究由動物所和美國賓夕法尼亞大學合作完成。