首次在新的臨床試驗中進行體內人基因組編輯測試

　　科學家們之前已編輯過人基因組，但總是在體外的細胞中開展的。如今，作為一家生物技術公司，Sangamo治療公司（Sangamo Therapeutics，以下稱Sangamo）正在招募參與者參加幾項臨床試驗：血友病B、赫勒綜合征（Hurler syndrome）或亨特綜合征（Hunter syndrome）患者具有非功能性的酶，通過鋅指核酸酶（ZFN）在他們的基因組上產生雙鏈DNA斷裂，將編碼功能性酶的基因插入到他們的基因組上。

　　Sangamo公司總裁兼首席執行官Sandy Macrae告訴《科學家》雜志，“這是首次一個人可能在其肝臟中具有一種新的基因。開展這些臨床試驗是一種榮幸，也是一種責任。”

　　Sangamo公司將重點關注的疾病之一是血友病B，它是由F9基因存在缺陷或缺失導致的一種嚴重的出血性疾病。這個基因的蛋白產物，即凝血因子IX，是血液凝結所必不可少的一種酶。

　　兩種其他的臨床試驗將著重關注赫勒綜合征和亨特綜合征。這兩種疾病的患者缺乏兩種不同基因的一種功能性拷貝。這兩種基因編碼降解參與發育、血管生成等過程的復雜多糖的酶。若沒有這些酶，被稱作糖胺聚糖（glycosaminoglycan）的特定多糖類型在細胞中堆積，這能夠導致神經問題、心血管疾病和其他癥狀。

　　在所有的這三項臨床試驗中，ZFN在人肝細胞中的白蛋白編碼基因的靶位點上進行切割，隨后這種基因的一種功能性拷貝通過同源重組而被整合到肝細胞的基因組中。

　　一項臨床試驗的初步階段涉及6名血友病B患者，這些患者每個將接受低劑量、中劑量或高劑量SB-FIX藥物靜脈注射，這種藥物由三種腺相關病毒（AAV）組成：兩種AAV含有產生ZFN的基因，第三種AAV含有功能性的F9基因。

　　Macrae說，研究人員期待F9 DNA將被整合到少量肝細胞中的白蛋白編碼基因的靶位點上，但是鑒于白蛋白在肝臟中高度表達，這些患者的凝血因子IX水平仍然能夠增加。一旦Sangamo公司評估了這種藥物的安全性和確定了它的最佳劑量，還有三名血友病B患者將作為最佳劑量組的一部分參加這項臨床試驗。

　　美國圣裘德兒童研究醫院兒科外科醫生Andrew Davidoff說，血友病B是“第一種能夠靶向的疾病，這是因為這種疾病生理學特征是非常明確的”。他解釋道，“如果你僅是替換這種缺失的或缺陷性的凝血因子，那么你將實際上治愈這些患者。”

　　Davidoff沒有參與Sangamo公司即將開展的臨床試驗，但是他已領導了血友病B男性患者的臨床試驗：AAV病毒將F9的一種功能性拷貝運送到肝臟中。在Davidoff的臨床試驗中，這個基因盒并沒有整合到病人的基因組中，而是作為被稱作附加體（episome）的基因組外DNA存在于肝細胞中。Davidoff解釋道，“鑒于沒有整合，如果靶細胞發生分裂，那么就可能丟失這些附加體。”

　　但是，即便F9沒有整合到基因組中，在Davidoff的臨床試驗中接受這種治療的這些男性患者仍然增加表達這種凝血因子，從而導致臨床癥狀改善。這些最早的參與者已在7年多的時間內表現出一致性的循環凝血因子IX水平。Davidoff說，“有些令人吃驚的是，情況一直很穩定。答案的一部分在于在沒有創傷或外科手術的情形下，肝細胞很少發生分裂。”

　　Macrae說，在當前的臨床試驗中，Sangamo策略的一種優勢在于它是“一種終生解決方案”。一旦這些ZFN促進F9基因的功能性拷貝整合到參與者的肝細胞基因組中，該基因就應當穩定地表達。

　　美國南加州大學凱克醫學院基因療法研究員Paula Cannon將這種白蛋白編碼基因描述為一種“安全港位點”---通過實驗確定適合基因插入和長期表達的基因組位點。Cannon并未參與當前的這些臨床試驗，但是她之前與Sangamo公司合作利用ZFN將一種基因整合到人細胞中，從而使得這些細胞的后代抵抗HIV感染。

　　Cannon 告訴《科學家》雜志，ZFN和CRISPR/Cas9基因組編輯系統都能夠以一種位點特異性的方式切割DNA，但是她補充道，在開發臨床療法時，ZFN也存在優勢。比如，CRISPR/Cas9存在一些限制，也就是，結合到靶序列上的向導RNA（gRNA）必須附著到一個錨定序列（通常含有兩個G堿基）上。她說，因此CRISPR/Cas9“并不會提供你想要的高度特異性。”

　　Cannon補充道，“ZFN有點較難以開發”，但是Sangamo公司開發的系統“給你提供非常特異性的和高度有效的ZFN。他們能夠讓ZFN切割任何一種特定的堿基。”

　　Cannon強調的ZFN的另一種優勢是它們的歷史和被美國食品藥品管理局（FDA）批準作為試驗性新藥。ZFN已成功地被用來敲除一種參與HIV入侵人T細胞的基因，而且當被注射到人體中時，這些細胞并沒有引發免疫反應。

　　ZFN的另一種益處在于它們比Cas9小，而Cas9是CRISPR/Cas9系統所必需的。Cannon說，“當在體外編輯細胞時，這并不重要。但是如果你想在體內處理組織，正如當前的這項臨床試驗那樣，那么你會研究一類被稱作AAV的載體。真地很難將Cas9插入到這類載體中，這是因為它太大了。”

　　但是，體內基因組編輯的一些障礙是普遍存在的。美國賓夕法尼亞大學醫學院病理學家Robert Doms（未參與當前的這些臨床試驗）說，“不論使用ZFN或者類似的TALEN或CRISPR/Cas9系統，它們都存在運送問題，也就是如何將感興趣的產物運送到特定的細胞而不是其他的細胞中。不論嘗試著做什么，這都是基因療法面臨著的一項挑戰。”

　　針對Sangamo公司當前的臨床試驗而言，將這些藥物中的任何一種運送到肝臟中是相當簡單的，這是因為AAV很容易經過血液入侵肝細胞。Macrae解釋道，其他的研究團隊已成功地將AAV運送到眼睛中，而且Sangamo公司可能很快對AAV到大腦中的運送進行優化。但是他同意將藥物運送到合適的組織中是一個迫在眉睫的問題。他說，“我相信未來使用和編輯應用的秘密在于運送。”