高效液相色譜串聯質譜法測定奶粉中的雙氰胺

1. 引言

雙氰胺又名二氰二氨，縮寫DICY 或DCD。是氰胺的二聚體，也是胍的氰基衍生物。白色結晶粉末，可溶于水、醇、乙二醇和二甲基甲酰胺，幾乎不溶于醚和苯。干燥時穩定。雙氰胺化肥，雙氰胺復合肥料可控制硝化菌的活動，使氮肥在土壤中的轉化速度得到調節，減少氮的損失，提高肥料的使用效率。農民普遍會在牧場使用雙氰胺，目的是防止硝酸鹽等對人體有害的肥料副產品流入河流或湖泊。新西蘭的奶牛養殖是采取放養的方式，如果草木干旱，奶農往往會使用一些肥料增強草木的抗旱性以及肥力，這就造成了污染。而由于新西蘭國內注重環保，因此使用雙氰胺對草木中的有害物質進行中和，這就導致了殘留的藥品流入奶牛體內，造成奶品的污染。2013年1 月25 日，新西蘭牛奶中發現了有害物質—雙氰胺。雖然國際標準未對食品中的雙氰胺限量，但高劑量的雙氰胺對人體是有毒的。

奶粉中雙氰胺的LCMSMS 檢測的難點在于：首先雙氰胺本身的分子量很小，極性很大，一般的C18 柱保留不住，其次嬰幼兒奶粉的基質非常復雜，含有大量糖類和蛋白質，必須有合適的前處理方法以獲得更好的凈化效果。本實驗選用Thermo Scientific Syncronis HILIC色譜柱配合Hypercarb 凈化柱，建立了雙氰胺LCMSMS的檢測方法，結果顯示該方法具有靈敏度高，重現性較好等特點。

2. 實驗部分

2.1 儀器與試劑：

TSQ Quantum Ultra 三重四極桿串聯質譜儀（賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有電噴霧電離源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高壓液相色譜

標準品：雙氰胺純度大于98％，內標雙氰胺-15N4 純度為95％。用乙腈溶解并配制成1.0 mg/mL 標準儲備液，再根據需要稀釋成適當含量的混合標準工作液。其他試劑均為HPLC 色譜純。

表1. 液相梯度

2.2 儀器方法：

2.2.1 液相條件：

色譜柱：Syncronis HILIC，100mm×2.1mm，5μm；

梯度洗脫程序見表1，其中A 為0.5mM NH4Ac（pH=4.0）水溶液，B 為乙腈。進樣量10μL.

2.2.2 質譜條件：

電噴霧電離源（ESI），正離子模式；選擇反應監控（SRM）掃描模式，噴霧電壓：3000V；氣化器溫度350℃，離子傳輸管溫度：350℃；氮氣作為鞘氣和輔助氣，其中鞘氣為30arb, 輔助氣為8arb，氬氣用作碰撞氣, 碰撞壓力為1.5mTorr; 選擇反應監測（SRM），離子對見表2。

表2. 化合物離子對信息

3 結果分析

3.1 靈敏度：

經實驗測定，雙氰胺的LOD 為0.25ng.mL-1，信噪比為20，提取離子流圖見圖1。

圖1. 雙氰胺最低檢測限圖

3.2 線性范圍

采用上述儀器方法進行測定， 雙氰胺在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 呈現良好的線性相關性，線性相關系數為0.9998， 濃度水平分別為：0.5ng.mL-1、1ng.mL-1、5ng.mL-1、10 ng.mL-1、50ng.mL-1、 100ng.mL-1，內標雙氰胺-15N4濃度為5ng.mL-1，線性方程見圖2。

圖2. 線性方程圖

3.3 精密度

對1ng.mL-1 的雙氰胺，采用上述儀器方法，連續進樣7針，計算RSD 值。結果為1.19%，離子流圖如圖3。

圖3. 平行進樣7 針的色譜圖

3.4 奶粉樣品分析

取某市售嬰幼兒奶粉試樣，進行添加回收實驗。奶粉的前處理方法如下：稱奶粉基質樣品2.000g，加10mL 1% 的甲酸/ 水提取液，渦旋震蕩提取5min，超聲萃取10min；冷凍離心機6000R/min，離心10min，取上清液5mL 到小離心管中，14000R/min 離心10min，上清液全部過凈化柱（3cc,200mg/Hypercarb），控制流速1mL/min，用10mL 超純水清洗柱子；用甲醇/ 乙腈（4/6）洗脫，接取洗脫液氮氣吹干（40℃），用1mL（乙腈/ 水，9 : 1）定容，0.22 微米有機濾膜過濾，上機檢測。結果表明，空白基質在雙氰胺及內標雙氰胺-15N4 的出峰位置沒有干擾，添加5ng.mL-1 的色譜圖如圖4，該圖中上方為基質添加，下方為基質空白。

圖4. 基質添加及空白基質色譜圖

結論：

TSQ Quantum Ultra 三重四極桿液質聯用系統檢測奶粉中雙氰胺具有靈敏度高、特異性好的優點，檢測定量限可以做到0.25ng.mL-1。并且該方法具有良好的線性范圍與精密度， 在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 的線性相關系數為0.9998，重復進樣7 針1ng.mL-1 的雙氰胺的RSD 值為1.19%。使用Hypercarb 凈化柱能很好的處理奶粉樣品，空白基質沒有干擾，證明該方法檢測雙氰胺具有很好的適用性。