高效液相色譜流動相的幾點注意事項

　　高效液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優化是確定色譜分析的主要工作。

　　一、 流動相溶劑的選擇

　　1.所選用的流動相溶劑要有一定的化學穩定性，不與固定相和樣品組分起反應，其純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩定性和重復性的要求。

　　2.溶劑應當不干擾檢測器的工作，溶劑應與檢測器匹配，選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長范圍內無吸收的流動相。

　　3.在制備分離中, 溶劑應當易于除去, 不干擾對分離組分的回收。

　　4.溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。

　　5.從實用角度考慮，溶劑應當價格低廉，容易購得，使用安全，純度要高。

　　二、流動相溶劑使用的注意事項

　　1.流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。 在送液泵內，為了防止雜物（固體）進入流路，裝有吸濾器，但網孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產生大量氣泡，會導致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產生噪聲信號等。

　　2.流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩定，特別是發生漂移，也容易產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。

　　3.做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。

　　4.流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的

　　5.用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。

　　6.若需要使用含鹽的流動相，使用前請務必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現用現配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。

　　7.進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統更換正相系統或正相系統更換反相系統時，用異丙醇置換系統內的儲存流動相后在接柱子。

　　8.在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。

　　9.儀器在短期（兩三天）不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。

　　10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。

　　11.當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。

　　12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。

　　13.用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。

　　14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。

　　三、液相色譜流動相的貯存

　　流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

　　磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。