高質量DNA的純化實驗

乳腺瘤組織

EDTA 異丙醇裂解緩沖液 細胞核裂解緩沖液 Triton 裂解緩沖液

水浴鍋 破璃棒

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

EDTA，100 mmol/L

異丙醇

裂解緩沖液

10 mmol/LTris-HCl

1mmol/LEDTA

150 mmol/LNaCl

0.5%SDS,pH10.5

NaCl，0.15mol/L 和 6mol/L

細胞核裂解緩沖液

75 mmol/LNaCl

24 mmol/LEDTA,pH8.0

蛋白酶 K 或者鏈霉蛋白酶，20 mg/ml。

SDS,200 g/L

蔗糖，lmol/L

Tris-HCl,2mol/L,pH9.2

Triton 裂解緩沖液

10mmol/LTris-HCl

5 mmol/L,MgCl2

1%TritonX-100

TE 緩沖液（lOmmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)

蔗糖，pH9.2

TritonX-100

2. 專用設備

水浴，預熱到 55°C

破璃棒

3. 細胞和組織

處理過的乳腺瘤組織（100 mg 組織用于激素受體分析）或者用 PBS 洗過 2 次的 5X105培養細胞。

二、方法

1. 向盛有細胞的 l0 ml 管中，加入 750ul 裂解緩沖液和 200ug 蛋白酶 K(或者鏈霉蛋酶);55°C 保溫至少 90 min, 直到沉淀溶解。

2. 如果沉淀不容解，重復步驟 1。

3. 加入 250ul 6mol/LNaCl, 小心地搖動。

4.4°C 離心（3000r/min)15 min。小心將上清液轉移到另一新管中。

5. 重復步驟 3 和 4。

6. 加入等體積的異丙醇，顛倒離心管直到看見 DNA。將 DNA 纏繞到玻璃棒上，沿管壁輕輕地將 DNA 拉出，將其轉移到 300ul 的 TE 或者滅菌雙蒸水中。

7. 放于 4°C，使其溶解。

從 10 ml 血液中提取 DNA

8. 加入 40 ml 預冷的（4°C)Triton 裂解緩沖液。

9.4°C 放置 30 min; 每隔幾分鐘將管子翻轉一下。

10.4°C 離心（3000r/min)30 min，棄上清液。

11. 用 5~15 ml0.9%(0.15mol/L) 的 NaCl 洗沉淀（細胞核）。

12.2300r/min 離心 10min。

13. 棄上清液。細胞核可以保存在-20°C。

14. 加入 3 ml 細胞核裂解緩沖液，搖勻。

15. 加入 25ul 鏈霉蛋白酶（20 mg/ml) 和 230ul10%SDS，室溫振搖過夜。

16. 加入 1ml6mol/L 的 NaCl，搖勾。

17.4°C 離心（3000r/min)15 min，小心將上清液轉移到另一新管中。

18. 重復步驟 10。

19. 加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管直到看見 DNA。將 DNA 纏繞到玻璃棒上，沿著管壁輕輕地將 DNA 拉出，將其轉移到 400ul 的 TE 或者滅菌雙蒸水中。

20. 放于 4°C, 使其溶解。