高通量測序中植物樣本的制備方法

高通量測序技術已廣泛應用于植物研究中，但植物材料中較多的蛋白質、多糖以及酚、脂類等次生代謝物質，提取核酸的難度往往比動物或原核生物樣本大，因此如何從植物樣本中得到高質量的核酸進行后續的測序，成為在植物高通量測序應用中的首要因素。根據核酸類型，可有如下制備方法可參考：

1. 植物基因組 DNA

主要應用于植物的全基因組測序、重測序等。植物的全基因組測序要求基因組 DNA 量至少在 50~100 μg，可采用經典的 CTAB 抽提方法，配方和步驟如下：

CTAB 裂解液配方：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，5% β-巰基乙醇 (隨用隨加)，

實驗步驟：

(1) 取 1-50 g 新鮮植物材料，于液氮中研成粉。

(2) 將凍粉轉入預冷的離心管中，立即加入等體積 (w/v) 2×CTAB 提取緩沖液，65℃ 保溫 10-20 分鐘，其間不時搖動。

(3) 加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，室溫下，12000r/min 離心 10-20 分鐘。

(4) 將上層水相轉入新的離心管中，加入 0.6-1 倍體積的異丙醇，混勻，室溫下放置 30 分鐘。

(5) 室溫下 12000r/min 離心 15 分鐘，去上清液, 70% 乙醇漂洗，沉淀晾干，加入適量 TE 緩沖液溶解 DNA，-20℃ 保存備用。

如植物材料富含多糖多酚，用 CTAB 方法抽提得到的 DNA 純度較差，也可將 CTAB 溶液做改良加高鹽沉淀，二可采用商業的基因組 DNA 純化試劑盒對 DNA 進行純化，在得到足量的 DNA 同時得到高質量的 DNA，Zymo Research 的試劑盒應用有不錯的效果。

重測序要求基因組 DNA 量相對少，可采用試劑盒 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit，成本相對低的有天根的 Plant Genomic DNA Kit。

2. 植物總 RNA

主要應用于植物的轉錄組、表達譜和小 RNA 等測序。植物總 RNA 的提取同樣可采用 CTAB 方法, 配方和步驟如下：

CTAB 裂解液配方：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB，2%PVP，10% β-巰基乙醇 (隨用隨加)。

實驗步驟：

(1) 取 1-5 g 新鮮植物材料，于液氮中研成粉。

(2) 將凍粉轉入預冷的離心管中，立即加入等體積 (w/v) 65℃ 預熱的 2×CTAB 提取緩沖液，65℃ 保溫 10-20 分鐘，其間不時搖動。

(3) 加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，4℃12000r/min 離心 10-20 分鐘。

(4) 將上層水相轉入新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，4℃ 12000r/min 離心 10-20 分鐘。

(5) 將上層水相轉入新的離心管中，加入 2.5 倍體積的預冷的無水乙醇，混勻，-70℃ 放置 60 分鐘。

(6) 4℃ 12000r/min 離心 15 分鐘，去上清液，70% 乙醇漂洗，沉淀晾干，加入適量 TE 緩沖液溶解 RNA，-20℃ 保存備用。

如植物材料富含多糖多酚，可采用 LiCl 沉淀 RNA，可有效的去除多糖等雜質。也可采用商業的植物 RNA 抽提試劑盒，天根和天恩澤的試劑盒有著不錯的抽提效果。需要注意的是 LiCl 沉淀和普通的柱式抽提試劑盒可能會去除相當一部分的小片段 RNA，因此這類的 RNA 抽提方法不適用小 RNA 測序。

以上是上海翰宇與大家分享的有關植物樣本抽提核酸的經驗，希望對大家有所幫助。上海翰宇生物會以專業的能力和熱忱的態度為您提供高通量測序及分析服務，期待與各位科研工作者的合作。