鴨源性核酸PCR熒光探針試劑盒操作要點解析

鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒操作步驟包括樣本的采集和保存、試劑和樣本的平衡、加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結果判定和結果報告。環節眾多，任一環節操作不當，皆可影響測定結果。因此，必須重視各環節操作，掌握控制要點，方能保證檢測結果準確可靠。
1  樣本的采集和保存  
 作為激素和治療藥物測定的樣本應考慮采集時間及體位等因素影響,可的松和促甲狀腺激素清晨會有一峰值出現；生長激素、促黃體激素、促卵泡激素均以陣發性方式排放；從臥位變為站位時，腎素活性將明顯增高；藥物濃度監測應根據藥代動力學選擇合適時間采集樣本。
內源性干擾因素對檢測結果的影響，如類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、鼠抗體診療所致抗鼠Ig抗體、溶菌酶等。可以通過稀釋、加熱、改變固相和酶標抗體、使用雞抗體IgY以及理化方法去除干擾因子。
外源性干擾因素對檢測結果的影響，溶血、脂血、細菌污染、血液標本收縮不充分、存貯過久、反復融凍等。
盡量使用玻璃試管抽血，慎用塑料試管盛血，因聚乙烯易吸附抗原和抗體，影響檢測結果。
2日內測定血液樣本，，置2℃—8℃冰箱保存；2日至7日內測定，置2℃—8℃冰箱保存；7日以上測定，置-20℃以下冰箱保存。 
2  試劑和樣本的平衡   
試劑和樣本在測定前應先放置室溫（20℃—25℃）平衡20分鐘以上，以保證后續操作步驟中抗原抗體足夠反應溫度。
3  加樣本及試劑   
鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒應正確使用移液器和試劑滴瓶。移液器應定期校準和維護，加樣本時，應加在微孔下1/3處，不可擦劃底部、沖起泡、加到微孔上緣或濺出。滴加試劑（包括抗原、酶結合物及顯色劑）時，應搖勻試劑，先棄去瓶口1—2滴，然后垂直、均勻加入微孔。
4  溫育  
溫育是ELISA操作中的關鍵步驟。國產試劑通常采用37℃30分鐘和37℃60分鐘兩種方式。為保證溫度均一，抗原抗體反應充分，宜采用水浴方式加熱。如用孵箱，可內置一方盤，底襯紗布，加入適量水，微孔板放入其中溫育。
5  洗滌  
ELISA為異相固態方式檢測，所以分離結合和游離酶結合物是一個重要環節，洗滌即是達到這樣一個目的。洗板質量直接影響檢測結果，所以需重視洗板質量。現在新推出的洗板機大多增設有兩點吸液、底部沖洗和振蕩等功能，可以充分保證洗板質量。手工洗板時，應嚴格按照試劑說明書操作，洗滌不足和洗滌過度都將影響檢測結果。
6  顯色  
ELISA顯色常用TMB和H2O2作為顯色劑，顯色時間37℃15—20分鐘，顯色過程可不避光。使用前應檢查顯色劑是否變質，嚴格控制顯色時間。顯色劑質量檢查，在玻片、試管或eppendorf管中滴入顯色劑A和B各一滴，若不變色，則質量可靠。繼續滴入一滴酶結合物，搖勻后幾分鐘內溶液出現藍色，既可檢查顯色劑質量，又可檢查酶結合物質量。
7  比色   
加終止液終止顯色反應后，通常要求30分鐘內用酶標儀完成比色測定。采用主波長450nm測定，可有效避免微孔上的劃痕、指印及其它附著物對光的干擾。另外，加終止液后，應盡快比色，因為呈色深的微孔易出現沉淀致吸光度下降明顯。
8 結果判斷和結果報告   
判斷結果時，鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒要正確按照試劑盒要求設置計算參數，內外對照值均應在控，才能判定測定結果有效。對于少見模式和臨界值附近結果應堅持復核