（雙光子、共聚焦）熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區別

　　最近試著做了一些小鼠的冰凍切片，接下來要使用熒光顯微鏡看自己打的病毒是否在自己想要的腦區。熒光顯微鏡的一些基本原理需要簡單學習一下，也在此分享一下。

　　熒光顯微鏡是利用紫外線為光源，用以照射被檢驗的物體，使該物體發出光源，然后在顯微鏡下進行對物體的觀察。主要是用于免疫熒光細胞，主要是由光源、濾板系統和光學系統組成的在通過目鏡和物鏡的放大來觀察樣本的熒光圖像。我們來看下這熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡有什么樣的區別。

　　1、在照明方式上看

　　熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上。

　　2、在分辨率上看

　　熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長比較短，但是分辨率卻高于普通的光學顯微鏡。

　　3、在濾光片上的不同

　　熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片，在光源前用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的使用來濾出紫外線，這樣可以保護人的眼睛。

　　熒光顯微鏡也屬于光學顯微鏡的一種，主要是熒光顯微鏡所激發的波長短，所以這才導致了熒光顯微鏡和普通顯微鏡雜結構構造和使用上的不同，熒光顯微鏡大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在極其微弱的熒光下，它的成像能力也和好。再加上近年來對熒光顯微鏡的不斷改善，噪音也大幅度降低。因此越來越多的熒光顯微鏡得到應用。

　　雙光子熒光顯微鏡有關知識

　　雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100飛秒，而其頻率可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。

　　在一般的熒光現象中，由于激發光的光子密度低，一個熒光分子只能同時吸收一個光子，再通過輻射躍遷發射一個熒光光子，這就是單光子熒光。對于以激光為光源的熒光激發過程，則可能產生雙光子甚至多光子熒光現象，這時所用的激發光源強度高，光子密度滿足熒光分子同時吸收兩個光子的要求。以一般的激光為激發光源的過程中，光子密度仍然不足以產生雙光子吸收現象，通常采用飛秒脈沖激光器，其瞬時功率可以達到兆瓦量級。因此，雙光子熒光的波長比激發光的波長短，相當于半激發波長激發產生的效果。

　　雙光子熒光顯微鏡有很多優點：

　　1）長波長的光比短波長的光受散射影響較小容易穿透標本；

　　2）焦平面外的熒光分子不被激發使較多的激發光可以到達焦平面，使激發光可以穿透更深的標本；

　　3）長波長的近紅外光比短波長的光對細胞毒性小；

　　4）使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來觀察厚標本、更適合用來觀察活細胞、或用來進行定點光漂白實驗。

　　共聚焦熒光顯微鏡有關知識

　　共聚焦熒光顯微鏡基本原理：采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。

　　每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。

　　即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發的熒光不能進入檢測針孔。

　　激光共聚焦的工作原理簡單表達就是它采用激光為光源，在傳統熒光顯微鏡成像的基礎上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制來進行數字化圖像采集和處理的系統。