Pacbio單分子實時測序技術于藥用植物基因組研究應用

　　藥源短缺成為限制臨床治療和新藥研發的最大瓶頸，因此，開發新的藥物來源途徑是迫切需要解決的問題。利用現代生物技術和次生代謝工程手段是未來生產藥物最有潛力的發展方向。我國藥用植物有1 萬多種，大多數藥用植物遺傳背景不清楚，基因組信息缺乏，遺傳信息和功能基因的研究亦極為薄弱。例如人參屬（Panax） 和紅豆杉屬（Taxus） 分別作為最重要的人參皂苷和紫杉醇天然來源植物，功能基因的研究亦相當有限。闡明和完善重要藥用植物次生代謝產物合成途徑及其調控研究，是一項緊迫的任務。

　　DNA基因測序技術從上世紀70年代起，歷經三代技術后，目前已發展成為一項相對成熟的生物產業。測序技術的應用也擴展到了生物、醫學、制藥、健康、農林、園藝、花卉、環保、法醫等許多領域，并成為一項與我們衣食住行密切相關的高技術產業。據最新統計，2012年全球基因測序市場的產值已超過百億，按最近幾年增長速度，預計2017年市場產值將加倍。因此可以說，基因測序在我國生物科技領域具有非常重要的戰略意義。

　　“第三代測序技術”的研發已有近十年時間，商業化的第三代測序儀上市也有三年,目前，國內科研單位老師也逐步選擇Pacbio單分子測序技術應用于藥用植物基因組研究應用：

　　一， 中科院藥植所揭示丹參葉綠體DNA修飾之間復雜的相互作用

　　2014年6月10日，中科院藥用植物研究所（IMPLAD）劉昶團隊在《PLOS ONE》雜志上發表了利用PacBio測序技術揭示丹參（Salvia miltiorrhiza）葉綠體DNA修飾之間復雜相互作用的相關文章，該文章報道了丹參葉綠體中編碼及非編碼RNA的表達情況。這也是國內PacBio第三代測序用戶在國際性雜志發表的第一篇文章。丹參是最廣泛使用的藥用植物之一。作為基于葉綠體基因工程手段開發使丹參活性成分過表達方法的第一步，該研究團隊從基因組，轉錄組，和堿基修飾三方面對丹參葉綠體進行了分析。先從新鮮葉片中提取總基因組DNA和RNA，然后進行鏈特異性RNA測序和PacBio公司的單分子實時（Single-Molecule Real-Time, SMRT）測序分析。實驗先是將RNA測序得到的reads mapping到基因組，使該研究小組確定了80個蛋白質編碼基因的相對表達水平。此外，還明確了19個多順反子轉錄單元和136個假定反義和基因間非編碼RNA（ncRNA）基因。將蛋白編碼基因的轉錄本（cRNA）豐度與重疊反義非編碼RNA（asRNA）相比較表明，asRNA的存在與cRNA的豐度增加有關（P<0.05）。使用SMRT Portal軟件預測到了2687個潛在的DNA修飾位點和2個潛在的DNA修飾基序。兩個基序包括TATA盒樣基序（CPGDMM1, ''TATANNNATNA''），以及一個未知的基序（CPGDMM2, ''WNYANTGAW''）。

　　研究采用二代和三代DNA測序技術并用，使在基因組層面研究非編碼RNA和DNA修飾成為可能。然而，原來關于反義RNA和DNA修飾研究在實驗上具有相當大的困難。首先，大多數asRNA轉錄本表達水平顯著偏低，因而難以用經典技術如Northern Blot和原位雜交進行驗證。第二，正義和反義轉錄本之間錯綜復雜的關系意味著實驗擾動會不可避免地干擾其他轉錄本的表達。因此，通過knocking-in和knocking-out技術確定轉錄本的生物學功能是復雜的。第三，雖然SMRT技術已被證明能夠檢測到潛在的DNA修飾，但驗證這些修飾仍然是個挑戰性的任務。第四，葉綠體asRNA和DNA修飾的存在和功能的驗證是更加困難的。

　　綜上所述，本研究所描述的一些發現從目前的技術上來講是有巨大進步的。然而，本研究提出的數據已經證實了由asRNA和DNA修飾引起的基因表達調控的復雜性。

　　二， 中國林業科學研究院完成首個木本藥用植物全基因組精細圖

　　中國社會科學院11月26日舉行《杜仲全基因組精細圖》繪制完成重大成果新聞發布會。這是世界上第一個橡膠植物全基因組精細圖，也是第一個木本藥用植物全基因組精細圖。

　　2012年7月，中國林業科學研究院經濟林研究開發中心率先啟動了杜仲全基因組測序和精細圖繪制項目。這是目前為止第一個完成全基因組測序的木本藥用植物，也是唯一的硬性橡膠植物全基因組。由于杜仲的栽培歷史悠久，雜合度高，基因組大，重復序列比例高，為極其復雜的植物基因組。經過中國林業科學研究院經濟林研究開發中心等研究人員共同努力，克服了組裝拼接技術難題，并在杜仲全基因組測序和精細圖繪制方面取得了突破性研究成果。

　　本研究首次在木本植物全基因組測序中科學地結合第二代和第三代測序技術，采用混合組裝方法，攻克了杜仲基因組的高雜合、高重復序列帶來的組裝困難等瓶頸問題；獲得了大量杜仲橡膠合成相關的功能基因，將加快高產膠杜仲新品種培育，有效降低杜仲橡膠產業化成本，促進杜仲產業健康快速發展；挖掘了大量杜仲藥用成分相關的功能基因，為篩選和培育杜仲高藥用成分新品種提供了堅實基礎；發現了大量杜仲抗逆性和環境適應性相關的功能基因包括耐熱基因、抗寒基因、抗旱基因、抗鹽堿基因、抗蟲基因等，揭示了杜仲適應性強的分子機制。

　　杜仲是名貴藥材，同時也是我國特有的世界唯一的硬橡膠樹種。其具有很高的藥用價值和保健功能。該成果對破解杜仲遺傳密碼、杜仲橡膠形成與高效合成機理，加快杜仲高產膠、高活性成份、高抗新品種培育進程，促進杜仲產業化發展具有重大意義。

　　藥用植物功能基因的研究，主要是為了發現藥用植物天然活性成分合成功能基因及其表達規律，確定有效藥用活性成分的生物合成途徑，了解其調控機制，同時研究其基因組多樣性，并將所得的序列信息用于品種鑒定、資源保護和擴大、種質繁育等多個方面。針對具有重要經濟價值的藥用植物和代表不同次生代謝途徑的模式藥用植物開展基因組系列研究，例如轉錄組序列測定、組裝和生物信息學分析，對于目前藥用植物功能基因研究還很不完善，大多數藥用植物缺乏基因組信息的現狀具有很大的現實意義。功能基因組學改變了經典的單個基因、蛋白、代謝產物的縱向的研究方式，取而代之的是全面、整體的基因、蛋白質、代謝產物的橫向研究方式。通過分析大多數(如果不是全部)參與特定生物學過程的分子，功基因組學尤其是轉錄組學研究，提供了生命活動的整體、全面的描述。

　　新一代單分子實時測序技術是對傳統測序方法的一次巨大的變革。PacBio RS測序儀系統全面解決了二代測序幾大困擾：海量數據拼接難，變異檢測假陽性高，稀有突變被淹沒，高GC含量區域無法跨越，高度片段無法準確測定等，得到高質量，完整的數據信息，為合作伙伴提供優質的基因組組裝，目標區域測序，堿基修飾檢測等技術服務。天津生物芯片在三代測序領域積累了豐富的經驗，針對不同物種基因組的各種雜合度、序列重復性等特點，將采用第二代測序技術和第三代測序技術結合的方法，可以幫助合作伙伴獲得相關的功能基因，能夠對理解物種的生物學和生物化學的各個方面提供新的信息，將有力地促進藥用植物資源更好地發展和利用。因此，單分子實時測序在藥用植物基礎理論和生產實踐中均具有重要的意義。它提供了一種快速、高通量、全面解讀藥用植物基因組信息的全新技術手段。為功能基因挖掘、藥用植物活性成分的生物合成與調控、藥用植物種質資源評估與擴大、探索藥材道地性分子機制提供了新的思路和方法。通過生物合成途徑和基因調控的研究，推動藥用植物次生代謝工程的發展，提高中藥材的品質，為中藥的良種選育、規范化種植和質量控制提供技術支撐。