2篇Science之后，顏寧再發2篇文章，在結構領域取得新突破

　　角鯊烯環氧酶（也稱為角鯊烯單加氧酶）是膽固醇生物合成中的關鍵限速酶。 Anil Padyana及其同事報告了人體角鯊烯環氧酶（SQLE）結構。他們單獨解決了人SQLE催化結構域的晶體結構，并與兩種相似的藥理學抑制劑復合，并闡明了它們的作用機制。SQLE是殺真菌劑的目標，并且與人類健康和疾病的聯系日益增加，特別是作為新的抗癌靶標。2019年2月21日，顏寧等人在Nature communications雜志發表了題為“The shape of human squalene epoxidase expands the arsenal against cancer”的精彩評論。

　　葡萄糖是新陳代謝的主要能量來源，也是生物分子合成的多功能前體。谷氨酸轉運體家族成員谷氨酸轉運體1或谷氨酸轉運體3在各種類型的腫瘤中過表達，這使得它們成為新的抗癌藥物發現的潛在靶點。2019年3月5日，顏寧團隊在Cell Discovery上發表了題為“Engineered XylE as a tool for mechanistic investigation and liganddiscovery of the glucose transporters GLUTs”的研究論文。該文中研究人員開發了一個體外分析系統，該系統包含不同構象的木質部，可用于初步篩選葡萄糖轉運蛋白抑制劑和區分外表面和內表面配體。

　　這也是顏寧團隊繼2019年開年以來2篇Science后厚積薄發，顏寧團隊Science背靠背同期發表2篇論文，闡述離子通道結構，在結構生物學研究領域又一次取得新成果。

　　Nature Communications：人類角鯊烯環氧酶的結構基礎擴大了抗癌的武器

　　SQLE正成為一個熱門話題，酵母同源物ERG1是特比萘芬等抗真菌劑的靶標。人體酶長期以來一直是潛在的降膽固醇目標，普通食品和飲料中的天然產品，如大蒜，紅酒和綠茶，可通過抑制SQLE2降低血液膽固醇水平。最近，人類SQLE作為真正的致癌基因和癌癥治療的目標已經獲得突出地位。

　　像大多數膽固醇酶一樣，SQLE位于內質網中，也可能位于脂滴上。該酶在真核生物中是保守的，在人SQLE和酵母ERG1之間具有45％的序列同源性。 SQLE催化膽固醇合成中的第一個氧合步驟，將環氧基團引入類異戊二烯角鯊烯中以形成2,3（S）  -氧代角鯊烯。在類異戊二烯可以折疊成特征性的甾體四稠環結構之前，需要這種環氧化作用，通過隨后的酶，羊毛甾醇合成酶催化的一些顯著的分子折射。

　　SQLE酶  -底物復合物的分子相互作用必須精確，以嚴格控制環氧化反應的區域和立體化學。得到的氧原子成為膽固醇的特征羥基。 該反應需要分子氧，FAD，NADPH和包括NADPH-細胞色素P450還原酶的電子轉移配偶體。 將底物遞送至SQLE的活性位點需要陰離子磷脂和脂質轉移蛋白，上清蛋白因子（SPF）。

　　過去二十年的工作研究了SQLE的幾個關鍵結構特征。 催化結構域含有FAD結合基序（G-Box，GD-和DG-基序），它們是黃素單加氧酶的特征。 DG指紋還用于識別NADPH輔因子，并且位于重組大鼠SQLE中通過光親和標記實驗鑒定為底物結合位點的一片殘基內。盡管已經針對各種來源的SQLE研究了底物需求、輔因子和抑制劑，但到目前為止還沒有結構模型可用。 此外，負責酶活性和抑制劑相互作用的結構域尚不清楚。

　　人類SQLE催化結構域的結構最終由Padyana及其同事揭曉。他們單獨測定了FAD結合的人SQLE的晶體結構，并用兩種有效的抑制劑NB-598和Cmpd-4“。盡管散布的一級序列，N末端截短的蛋白質含有三個不同的結構域，FAD結合結構域，底物結合結構域和C末端螺旋膜結合結構域。兩種抑制劑結合的結構非常相似，其中抑制劑深埋在細長的疏水隧道內，疏水隧道在黃素組旁邊有一個開口。與結合抑制劑的結構相比，未結合的結構在底物結合結構域中表現出輕微的構象轉變。特別地，與底物結合結構域中的抑制劑氫鍵結合的保守Y195殘基與FAD結合結構域中的殘基Q168一起遠離氫鍵。突變Y195幾乎完全消除了催化活性，支持了Y195-Q168之間相互作用的功能意義。

　　結合抑制劑的隧道也可能是角鯊烯結合位點，作者提出了基于對接實驗的角鯊烯結合SQLE模型。有趣的是，盡管有結構意義，動力學分析表明NB-598和Cmpd-4“具有非競爭性抑制作用，作者認為抑制劑的結合模式緩慢而緊密。該結構還提供了對SQLE立體和區域特異性催化作用機制的深入了解。

　　人類SQLE催化結構域的晶體結構無疑是對人類健康和疾病至關重要的，同時對該領域感興趣的研究人員來說也是一大福音。實際上，隨附的化學生物學研究提供了更有說服力的證據，證明SQLE在某些癌癥中具有突出的作用。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41467-019-08866-y

　　Cell Discovery：顏寧團隊在葡萄糖轉運蛋白研究領域再次取得新成果

　　細胞對葡萄糖的攝取主要依賴于兩種類型的葡萄糖轉運蛋白，鈉梯度驅動的葡萄糖轉運蛋白SGLT家族和促進型單轉運蛋白GLUT家族。腫瘤細胞對葡萄糖的攝取顯著增加，以彌補糖酵解產生三磷酸腺苷的效率較低，這種現象被稱為沃伯格效應。GLUT和XylE都含有中心底物結合位點，其在向外和向內的狀態下容納配體。然而，由于伴隨向外和向內構象之間的轉換的局部結構移位，該初級結合位點經歷輕微的構象變化。此外，麥芽糖結合的GLUT3的結構揭示細胞外側的潛在的二級葡萄糖結合位點，其在細胞內側缺乏。

　　研究試圖解決兩個問題。第一，XylE在外向和內向構象（如GLUT1）中是否具有相同的不對稱結合親和力？其次，可以用XylE來區分GLUTs的面部和面部配體嗎？為了測試這個命題，研究人員試圖設計出具有組成型向外或向內狀態的XylE變體。研究人員首先進行了域間交聯實驗。基于該結構，研究人員鑒定了兩對Cys取代的殘基。預測雙突變V35C / E302C（ExoCC）和A152C / S396C（EndoCC）分別在氧化條件下在細胞外和細胞內形成二硫鍵，因此分別將蛋白質鎖定在面向內和面向外的位置。

　　為了驗證設計的二硫鍵的形成，研究人員將DrICE蛋白酶特異性切割位點（DEVDA）引入細胞內螺旋ICH3。在存在二硫鍵的情況下，預計DrICE對XylE變體的切割在還原環境中產生兩個條帶，但在氧化條件下僅產生一個條帶。 XylE變體，ExoCC和EndoCC在交聯前在尺寸排阻色譜上保持良好的行為。純化的ExoCC和EndoCC經歷Cu2+氧化以形成二硫鍵。用凝膠過濾和SDS-PAGE檢查交聯的XylE變體，其也顯示出良好的蛋白質行為和高交聯效率。 Drice在氧化和還原條件下的裂解證實了二硫鍵的形成。

　　研究人員使用設計木質部變體的研究揭示了木質部外向和內向狀態之間的不對稱底物結合親和力，證實了SP成員之間的保守機制。利用轉運周期中的這種不對稱特性，研究人員開發了一個體外分析系統，該系統包含不同構象的木質部，可用于初步篩選葡萄糖轉運蛋白抑制劑和區分外表面和內表面配體。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41421-019-0082-1