20分鐘檢測新冠！諾獎得主開發核酸檢測新技術

　　當前，COVID-19 在世界范圍內大流行，已造成超過兩億人次的感染和四百多萬人次的累計死亡，基于 qRT-PCR（定量逆轉錄酶-聚合酶鏈反應）的檢測是當前診斷 COVID-19 的金標準。盡管說這種方法具有很高的敏感性，但其操作仍然過于復雜，檢測時間長達數小時，無法實現快速的即時檢測。因此，開發比 qRT-PCR 更快速、更容易實施的診斷檢測策略顯得尤為重要。

　　CRISPR/Cas 系統是用于基因編輯的分子生物學工具，有準確識別和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的諾貝爾化學獎也頒給了 CRISPR 基因編輯技術。隨后，多項 CRISPR-Cas9 基因編輯臨床實驗開啟并獲得突破性結果，并已成功應用于人類疾病的治療。

　　與 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特異靶向 RNA 序列，能夠在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表現出不加區別的切割活性。這一特性使其不能被用于基因編輯，但對診斷來說卻是個獨特的優勢，例如通過切割降解已標記的核酸來產生熒光信號，具有被應用于核酸檢測的潛力。

　　2021 年 8 月 5 日，加州大學伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的諾貝爾化學獎得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科學家領導的研究團隊在 Nature Chemical Biology 雜志上在線發表了題為 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。

　　研究人員結合了兩種不同的 CRISPR 酶，創造了一種能在一小時內檢測到少量病毒 RNA 的方法，這種被稱之為快速串聯集成核酸酶檢測（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT）的無擴增技術，可以為許多傳染病及當前流行的 COVID-19 提供快速且廉價的診斷策略。

　　主要研究內容

　　LbuCas13a 結合嗜熱棲熱菌 Csm6（TtCsm6）可用于快速 RNA 檢測

　　Csm6 是一種 III 型 CRISPR-Cas 系統的 RNA 內切酶，可被激活以切割細胞中的各種 RNA 分子，基于其信號放大的內源性功能，有可能提高 RNA 檢測的敏感性。

　　通過篩選，研究人員發現寡核苷酸 A4-U6 可結合并刺激 TtCsm6 對報告蛋白的切割，并釋放出熒光分子。此外，不同濃度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分鐘內出現熒光增長，隨后達到一個平臺值，最終熒光水平與 Csm6 激活劑的數量成正比。

　　在熒光已經趨于平穩的 LbuCas13a-TtCsm6 反應中加入 A4-U6 激活劑可以迅速增加 TtCsm6 對靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 則沒有影響。這些數據表明 Csm6 的 A4>P 配體會隨著時間的推移而耗盡，從而使其 RNA 切割活性失活，而這種失活則限制了其產生熒光信號的數量。

　　Csm6 激活劑的化學修飾

　　為了解決 Csm6 激活劑失活的難題，他們想到了位點選擇性化學修飾的方法，實驗結果發現，這種策略不僅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同時還能保持 Csm6 的高水平激活狀態，使其可以反復切割和釋放與 RNA 相關的熒光分子。靈敏度比未修飾的 A4-U6 激活劑提高了 100 倍。

　　RNA 檢測的可編程性

　　為了使 TtCsm6 及其修飾的激活劑能夠用于提高 RNA 檢測的靈敏度和檢測速度，必須保留用于串聯檢測的 CRISPR 核酸酶的可編程特性。

　　為此，他們將 TtCsm6 及其激活劑添加到一個 LbuCas13a 蛋白中，該蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原體 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列進行檢測，發現其具有相似的靈敏度和動力學，這表明，這種「一步法」可以對不同的 crRNA 序列進行編程，因此可能適用于幾乎任何 RNA 序列的檢測。

　　為了確定添加 TtCsm6 是否能加快檢測時間，他們在反應 20 分鐘后比較了這兩種檢測策略的結果，發現同時含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的試劑盒在 20 分鐘內即可完成對每微升 31 個拷貝的樣品檢測。

　　綜上這些結果表明，通過優化 LbuCas13a 的 crRNA 和化學修飾的 TtCsm6 激活劑，串聯 CRISPR 核酸酶檢測能夠實現對傳染性病原體 RNA 序列的無擴增檢測，在加速檢測病原體的同時兼具高靈敏度，他們稱這種策略為快速串聯集成核酸酶檢測（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT）。

　　集合檢測器實現 FIND-IT 即時檢測病毒 RNA

　　最后，為了證明將上述 FIND-IT 納入即時測試流程的可行性，他們開發了一種便捷檢測器，該檢測器由一個帶有反應室的微流控芯片、一個將反應維持在 37℃ 的加熱模塊和一個熒光成像系統組成。

　　將含有靶標 RNA（SARS-CoV-2 RNA）或水（無靶標 RNA）的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反應室內，1 小時后發現，當 SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷貝時，反應信號呈非線性增加，1 h 內增加約 4.7 倍；而不含靶 RNA 的陰性對照則出現約 1.7 倍的變化。

　　此外，與背景對照相比，每微升反應 400 拷貝的熒光量增加了 270%，而兩個陰性對照的熒光量則同時增加了 3%。鑒于陽性和陰性樣品之間熒光信號的巨大差異，這表明 LbuCas13a-TtCsm6 反應可在一個緊湊的檢測器中實現，并可以用于即時診斷檢測。

　　結語

　　綜上所述，在這項研究中，該團隊證明了 LbuCas13a 與 TtCsm6 聯合可用于快速 RNA 檢測，對其激活劑進行化學修飾后可使其敏感性提高約 100 倍。同時，將 TtCsm6 與含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效應體相結合，也可使提取的病毒 RNA 檢測低至每微升 31 個拷貝，60 分鐘檢測準確率更是達到 100%。最后，他們還將這種分析策略應用于集成檢測設備，保證了其便捷性。

　　因此，這種「一鍵式」檢測策略具有高靈敏性和快速的反應能力，未來可廣泛應用于檢測 SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或細胞 RNA 序列或環境樣本中的植物、真菌或微生物 RNA。

　　不過，使用 FIND-IT 實現完整的即時檢測還需要進一步開發合適的樣本收集和處理程序，以及強大的數據分析流程，將來仍需要進行更多人類樣本的測試，以驗證其在臨床樣本檢測中的穩定性和準確性。

　　本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「這種串聯核酸酶方法——Cas13 聯合 Csm6，在 37℃ 的單一溫度下發生反應，并不需要其他診斷技術所需的高溫加熱，這為更快更簡便的測試提供了可能，同時這些測試的靈敏度當前已經可以達到與其他檢測技術相當的水平，并且可能在未來做到更加靈敏。」

　　研究團隊在接受采訪時說到：「雖然我們確實是為了 COVID-19 而啟動了這個項目，但我們認為這種特殊的技術不僅僅適用于此次疫情，因為 CRISPR 是可編程的，因此可以將針對流感病毒、HIV 病毒或任何類型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，該系統均可用相同的方式工作。這一研究證明了這種生物化學方法是一種更簡單的檢測 RNA 的方法，并且快速敏感，這可能被應用于未來的即時診斷中。」

　　End

　　參考資料：

　　[1]Liu, T.Y., Knott, G.J., Smock, D.C.J. et al. Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases. Nat Chem Biol (2021).[2]Larremore, D. B. et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Sci. Adv. 7, eabd5393 (2021).

　　[3]Liu,T.Y.&Doudna,J.A.Chemistry of class 1 CRISPR–Cas effectors: binding, editing, and regulation. J. Biol. Chem. 295, 14473–14487 (2020).