2016年《科學》綜述：超分辨率顯微技術

從列文虎克到21世紀，顯微鏡由一個看似牢不可破的原則所控制：分辨兩個對象的能力受限于觀察它們的光波波長。 但在2000年，研究人員顯示出， 這種所謂的衍射極限可以被打破， 在接下來的十年中揭示了從 GSDIM和 PALM到 SIM、STED 和 STORM 的一系列像“字母湯”一樣的超分辨率技術 。

不，這并不是審稿編輯出了問題，這句話末尾真的有兩個句號。。你的大腦抓住了這個明顯的錯誤，因為你眼睛晶狀體所具備的分辨能力足以區分兩個緊挨著的物體。當然，顯微鏡可以解析更細微的細節，但這種能力不是無限的。所謂的阿貝（或衍射）極限限制著顯微鏡的能力，而且在某種情況下，兩個物體會顯示為一個。 

2006年，哈佛大學莊小威團隊首先闡述了被稱為隨機光學重建顯微鏡（STORM）的超分辨率技術，這是一種單分子定位方法，其20納米的橫向（xy）分辨率超過衍射極限達整整一個數量級。 

在接下來的十年中，莊小威的團隊穩步改進技術，做到了多色、更高分辨率和三維化。 

“幾乎所有生物結構都是三維的。”霍華德·休斯醫學研究所研究員、哈佛David B. Arnold Jr.科學教授莊小威說， “因此如果你只在xy（平面）上打破你的衍射極限，而不是z，你就會受到限制。” 

為了克服這個限制，莊小威的團隊在顯微鏡的光路上插入了柱面透鏡。在該裝置中，從單個分子產生的光不再是圓的而是橢圓的，表明分子的軸向位置具有50納米的分辨率。隨后，實驗室通過將物鏡定位在樣品上方和下方來進一步提高分辨率，使柱面透鏡組合時所產生軸向位置的分辨率優于20納米。 

當她的團隊應用這種技術固定大鼠海馬神經元時，他們得到了完全出乎意料的發現，莊小威說。在常規熒光顯微鏡下，肌動蛋白在這些神經元的軸突中看起來像一致而無特色的綠色。但是當他們使用STORM放大時，就在軸突軸的質膜下面，他們發現了一個實實在在的細胞骨架：綠色肌動蛋白的周期環隔著有180 納米，被洋紅色血影蛋白間隔著。 

“這是一個美麗的結構。”莊小威說，同時提供了機械化的靈活性和組織化的架構。有了它，細胞可以精確定位關鍵的膜蛋白，如離子通道，以確保神經沖動的有效傳送。“有了這些非常重要的信號分子固定在結構上，為你提供了解釋這種情況的可能性。”她補充說，“這是我最自豪的那些STORM圖像之一。 

莊小威發表于2013年的此項研究是“一個重大的貢獻”，耶魯大學醫學院細胞生物學和生物醫學工程副教授Joerg Bewersdorf表示認同，他在其實驗室中構建了超分辨率顯微鏡（包括現在已由Bruker商業化的顯微鏡）。 “從未有人看到過這些肌動蛋白環，即使人們為了了解軸突中的肌動蛋白組織，已經用電子顯微鏡看了20年。” 

詮釋超分辨率 

德國馬普生物物理化學研究所Stefan Hell教授在2000年首次打破了衍射屏障，他認為，所有超分辨率方法都是基于相同的基本原理。 

“如果你有自由傳播的光，這束光將總會被衍射。你不可能將它更精確地聚焦在小于光波波長約一半的區域。”Hell這樣解釋。結果就是，距離小于200納米的對象將被同時照射并一起發出熒光。長話短說：多個對象一起變成了一個無法區分的模糊影像。“這個問題的解決方案是要確保，并不是所有充滿激發光的對象最后都能發射熒光。” 

STORM、光激活定位顯微技術（PALM）和具備單獨分子返回的基態損耗顯微技術（GSDIM）分別得到了Nikon，Zeiss和Leica公司的商業化。它們是基于定位的隨機方法，使用可光活化或可光開關的熒光蛋白或染料隨機打開幾個熒光團，剩余的大多數保持黑暗。在這些條件下，研究人員可以相對確定每個熒光點僅響應于單個活性分子，因此可以以納米精度分配它們的位置。然后這些熒光團關閉，再打開另外幾個，并且循環重復，直到完成完整的數據集收集。 

“基本上我們是利用了我通常所說的‘第四維’。”莊小威解釋說。如果有多個的話，原本難以區分的對象會在空間中緊密定位，她說，“我們不允許它們在時間上有所重疊。 

相反，受激發射損耗（STED）、可逆可飽和光學熒光躍遷（RESOLFT）和結構化照明顯微技術（SIM）使用“光的模式決定了分子在何處是有活性的，何處是關閉的”，Hell說。Hell開發了STED和RESOLFT方法，并共同創立了一家名為Abberior的公司，為這些及其它超分辨率方法提供商業化的熒光團。例如，STED通常被用于實現點掃描方法，使用疊加在激發束上的“環形”光，通過一個被稱為“受激發射”的過程迫使在照明體積周邊的熒光團保持黑暗， “從而將發射區域收縮到圓環的中心。（RESOLFT使用可光開關的熒光團以達到相同的效果。） 

根據Leica Microsystems的STED和GSDIM顯微鏡產品經理Jochen Sieber所說，與STED或RESOLFT相比，定位系統通常能提供更清晰的分辨率，但所需的時間要長的多，因為它們需要采集和合并成千上萬幀影像以構建單個圖像。（的確，美國國立衛生研究院杰出研究員Jennifer Lippincott-Schwartz注意到，這第一批圖像的收集需要幾個小時；而如今，典型的幀速率大約是5分鐘。Lippincott-Schwartz的實驗室發明了PALM。） 

由Nikon、GE生命科學和Zeiss公司所商業化的SIM通常被認為是市面現有的最快也是最簡單的方法，因為它不需要特殊的樣品制備。但若到達100納米，它所產生的分辨率也最低。 

最近，Janelia研究園研究員Eric Betzig因其在超分辨率上的貢獻，與斯坦福大學的Hell和William E. Moerner共同獲得了2014年的諾貝爾化學獎，證明了即使這個限制也非不可逾越的。2015年末，Betzig和他的團隊找到了兩種策略，包括“具有模式化激活的非線性SIM”，從而將該方法的分辨率提高到約45納米。“我個人的感覺是，SIM的超分辨率方法很可能在未來十年能夠回答最多的生物學問題。”Betzig笑著說，“但這并不在諾貝爾獎之中。” 

英國曼徹斯特大學醫學研究委員會（MRC）職業發展研究員Raman Das在2014年解決了類似的問題，當時他使用SIM（以及其它方法）發現了一種細胞分裂的新形式，被稱為“頂端脫落”。Das感興趣于胚胎脊髓中的祖先細胞如何分化成神經元并離開組織。通過使用延時衍射限制熒光顯微鏡和SIM，Das的團隊發現這些細胞實際上修剪掉了細胞的“尖端”，一下子就去除了這些蛋白質——Das將它比作合上帶拉繩的手提袋的過程。 “這導致這些細胞的細胞極性快速丟失。”他解釋說，從而引起功能性神經元結構的形成。 

也許最簡單、當然也是最便宜的超分辨率選擇是擴展顯微鏡。該技術由麻省理工學院的Ed Boyden開發，通過將樣品包裹在“可膨脹聚合物”凝膠中來提高成像分辨率，使得樣品等軸地增長了約五倍。在功能上，這與提升分辨率（從200納米降至40納米）是一樣的。“這有點像光學變焦。”德國哥廷根大學教授Silvio Rizzoli解釋說，他在神經突觸研究中采用了這種技術（以及STED和STORM）。 

熒光團的開關 

馬普生物物理化學研究所線粒體結構和動力學研究小組負責人Stefan Jakobs使用超分辨率方法研究線粒體在細胞死亡或細胞凋亡中的作用。目前，已知一種被稱為Bax的蛋白質在響應凋亡信號中誘導線粒體膜破裂。但不清楚的是該蛋白質是如何做到的。 

使用固定細胞STED，Jakobs的團隊展示出多個Bax分子組裝成線粒體外膜中的環，如透明的綠色光環籠罩在紅色的膜上。該結構解釋了在凋亡期的Bax易位如何導致線粒體內容物溢出，Jakobs說。“看來這些環狀物代表著毛孔。”他解釋說。然而，他們不可能通過常規顯微鏡分辨出來，這些環在其中表現得“一團模糊”。 

為了看到這些環，Jakobs用到了熒光染料標記的抗-Bax抗體。然而，適用于超分辨率顯微鏡的熒光探針有時難以獲得。“你想要快速的圖像采集和高分辨率；你想要有很多顏色和低光毒性。目前沒有一種技術可以完全實現所有這些參數。”他說。 

Jakobs已經開發了可逆可切換的熒光蛋白（RSFP）——屬于綠色熒光蛋白（GFP）的變體，例如rsEGFP2——它可以被重復地從熒光狀態推到非熒光狀態，再使用特定波長的光推回。他指出，這種蛋白質適用于RESOLFT和STED在活細胞中的應用，因為它們不需要加入外部抗體進行標記。但是絕對不要過量表達這些蛋白質，他說，因為這可能引起人為干擾。因此，Jakobs的團隊使用被稱為CRISPR / Cas9的基因編輯系統將rsEGFP2與蛋白質編碼基因偶聯，從而確保了內源性表達水平。這項工作是“具有挑戰性的”，他承認，“但我認為對這個領域來說這是非常重要的一項工作。” 

另一種遺傳標記的選擇涉及到使用自標記蛋白標簽來標記基因，包括SNAP標簽和CLIP標簽（可從New England BioLabs獲得）或Promega的Halo Tag標簽。研究人員可以通過加入連接到適當底物的透膜染料，特異性標記活細胞中感興趣的蛋白質。當然，竅門在于，這種染料必須是明亮并具有細胞滲透性的，當前只有少數幾個熒光團符合該標準，瑞士洛桑聯邦理工學院化學科學和工程研究所教授Kai Johnsson說。 

Janelia研究園的研究員Luke Lavis最近報道了一組具細胞滲透性和高量子效率的羅丹明變體，可與Halo Tag化學標簽配合使用。Johnsson同樣也開發了羅丹明變體并稱其為“SiR染料”（羧化的硅—羅丹明），已經由Spirochrome公司開展商業化。 

通過將這些染料與靶向配體（例如DNA熒光染料Hoechst或癌癥藥物紫杉醇）偶聯，Johnsson創建了能夠在活細胞STED和SIM（而不是PALM或STORM）中分別特異性點亮遺傳物質和微管的探針。 

鮮活的色彩 

由于在定位超分辨率顯微鏡中編譯圖像需要更長的時間，該方法很可能不適用于活細胞。 

一種解決方案是用高速科學互補金屬氧化物半導體（sCMOS）相機，代替傳統的電荷耦合原件（CCD），它可以每秒捕獲成千上萬幀。舉例來講，2013年，Bewersdorf及其同事展示了噪聲處理算法，讓sCMOS相機可以高達每秒32幀的速度記錄超分辨率的圖像。如今，Leica公司的GSDIM儀器包括一個sCMOS攝像頭，可以將數據采集時間縮短到“一分鐘以內”，產品經理Peter Laskey說，因此讓其對活細胞的應用“觸手可及”。Nikon公司新推出的N-STORM 4.0系統也聲稱有更亮的激光，可以“讓閃爍的開關率非常之高”，總經理Stephen Ross說。 

研究人員還設計了其它替代策略來規避速度的問題。例如，Melira Lakadamyali是西班牙巴塞羅那光子科學研究所的團隊負責人，她研究微管囊泡運輸，特別是如何使運輸這些囊泡的動力蛋白可以“在活細胞擁擠的環境中逃避路障和交通擁堵”。 

為了回答上述問題，Lakadamyali發揮了她的系統的優勢。通過記錄囊泡在高時間尺度（但低空間尺度）分辨率的活細胞影像，她的團隊可以跟蹤囊泡運動，將這些軌跡疊加在微管位置的STORM圖像上。 

研究人員發現，囊泡傾向于在微管相交處停頓；這種暫停“與這兩個微管的間隔很小、緊密相交相關”，Lakadamyali說。但他們同時發現，馬達最終可以導航通過相交點。該團隊現在正在使用3D粒子跟蹤來關注與微管相關的原絲，這可能會為穿過路障提供類似于路肩一樣的幫助。 

倫敦國王學院皇家學會大學研究員Susan Cox同樣對活細胞定位顯微技術感興趣。Cox與Lippincott-Schwartz合作開發了一種算法，被稱為“閃爍和漂白的貝葉斯分析（3B）”，允許研究人員同時成像更多的熒光團，其中一些實際上甚至是在空間上重疊的，從而將每個實驗所需的圖片數量減少了大約一個數量級。“我們已經看過像心肌細胞這樣的系統，并且能夠在細胞的‘節拍’之間進行成像。”Cox說。 

然而，高分辨率所有能教會我們的是，顯微技術是一種平衡。在報告中，Betzig說，他通常會展示一個四面體，其軸代表著不同的目標：分辨率、速度、低光毒性和成像深度。“你不能擁有所有的一切，”他告訴聽眾。對于Betzig來說，速度是至關重要的，他將自己的努力聚焦在從他的樣品中擠出每一個光子。這就是他為什么開始從單純的超分辨率逐漸走向超高速成像，有著被稱為“格子光片顯微技術”的新設計，很快就要在Zeiss和3i公司進行商業化。 

當然，其他人可以從不同的角度解釋四面體。但底線在于：當談到顯微鏡，未來從沒有如此光明——或如此清晰。

（譯者之一高大海系中國科學院海洋研究所助理研究員）

Jeffrey M. Perkel 是愛達荷州波卡特洛市的科學自由撰稿人。
    DOI: 10.1126/science.opms.p1600105
    鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2016 年5 月12 日《科學》雜志”。官方英文版請見http://www.sciencemag.org/custom-publishing/technology-features/superresolution-microscopy。