2019nCov藥物研發進展和策略

　　一、2019-nCoV的簡要回顧

　　目前的研究表明，新型肺炎是指由新型冠狀病毒（2019-nCoV）引起的呼吸道疾病。因此，新型肺炎藥物的研制離不開對2019-nCoV的認識。

　　2020年2月3日，上海公共衛生臨床中心、復旦大學公共衛生學院張永振教授團隊和中科院武漢病毒研究所石正麗教授團隊分別在Nature上發表文章A new coronavirus associated with human respiratory disease in China和A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin，報道了此次武漢新型冠狀病毒。

　　這篇文章確定了新型冠狀病毒的基因組（注：張永振教授是第一位公布該病毒序列的科研工作者，1月10日公布序列，病毒完整基因組已存入GenBank，登記號為MN908947）。

　　而石正麗團隊的這篇文章，發現七個被鑒定和測序出的非結構性蛋白也存在于SARS冠狀病毒中，表明該病毒是一種與SARS相關的冠狀病毒，將其命名為新型冠狀病毒2019（2019-nCoV）。此外，確認了2019-nCoV進入細胞的路徑與SARS冠狀病毒一樣，即通過ACE2細胞受體。

　　冠狀病毒主要通過S蛋白上的受體結合結構域與細胞受體特異性結合，結合后，誘導S蛋白構象發生改變，介導病毒包膜與細胞膜發生融合，使病毒核衣殼進入細胞內進行后續病毒的復制。

　　血管緊張素轉換酶2（ACE2）是SARS-CoV受體。ACE2與S蛋白相互作用，可能也介導2019-nCoV感染肺Ⅱ型肺泡細胞。

　　通過以上兩篇Nature文章，我們知道了這是個什么病毒，同時，我們也知道了這個病毒進入細胞的可能方式，這對于我們認識一個新的病毒來說，是非常重要的，對藥物研發也一樣。

　　二、關于新型肺炎藥物的國內進展及研發策略

　　目前，隔離新冠病毒感染者是控制疫情的主要辦法，而最終可以控制疫情進而預防2019-nCoV感染的是使用保護性疫苗。盡管疫苗的開發迫在眉睫，但目前還沒有找到合適的新冠病毒的治療方案。

　　2020年2月7日，Robert L. Kruse（約翰斯·霍普金斯醫院)在F000 Research發表文章《Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China》,探討了治療2019-nCoV感染的潛在方案。本文總結了新冠病毒的潛在治療策略，主要包括：已有藥物的再開發利用；中和性單克隆抗體療法；靶向病毒RNA的寡核苷酸策略；開發可溶性病毒受體蛋白（ACE2-Fc）。（注：該文還在等待同行評審，目前還不是終稿）

　　1.重新利用現有的抗病毒藥物

　　對抗2019-nCoV的理想藥物是小分子藥物，它們可以抑制病毒生命周期的不同方面，最終抑制病毒的復制。兩類潛在的靶點是病毒聚合酶和蛋白酶抑制劑，目前主要是用來抗人類免疫缺陷病毒（HIV）和丙肝病毒（HCV）。臨床醫生們已經用各種不同的抗病毒藥物進行了初步的臨床研究。在以前的每次病毒爆發中都是采取這種方法，但是效果不明顯。

一名患者于1月25日抵達武漢紅十字醫院。武漢的科學家們已經開始了一項研究，測試現有的抗病毒藥物抵抗新型冠狀病毒的能力。圖片來自HECTOR RETAMAL/AFP/GETTY IMAGES

　　據Lancet雜志1月24日的報道，武漢市金銀潭醫院已經對首批41名患者進行了聯合使用洛匹那韋（lopinavir）和利托那韋（ritonavir）這兩種抗艾滋病藥物的試驗，藥物的靶標是一種蛋白酶。（詳見BioArt的回答：1 月 29 日全國新型肺炎確診 7711 例，死亡 170 例，目前的防治情況怎么樣了？）。有初步報道稱，作為HIV蛋白酶抑制劑的洛匹那韋和利托那韋對2019-nCoV有一定的臨床療效。

　　2020年2月4日，中國科學院武漢病毒研究所/生物安全大科學研究中心與軍事科學院軍事醫學研究院國家應急防控藥物工程技術研究中心開展聯合研究，在抑制2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）藥物篩選方面取得重要進展。相關研究成果以“Remdesivir and Chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro”（《瑞德西韋和磷酸氯喹能在體外有效抑制新型冠狀病毒（2019-nCoV）》）為題發表在中國自主知識產權的國際知名學術期刊Cell Research（《細胞研究》）上。（注：瑞德西韋（Remdesivir，GS-5734）是核苷類似物，目前在剛果（金）開展治療埃博拉出血熱的Ⅱ和Ⅲ期臨床研究。）

　　2. 中和新冠病毒抗體的開發

　　針對2019-nCoV病毒表面S蛋白的中和抗體的開發是研究人員首先考慮的治療方法，其為疾病提供被動免疫。研究人員可通過最近發表的2019-nCoV基因組序列（GenBank:MN908947.3）進行基因合成，并表達S蛋白作為免疫原開發抗體。傳統上，采用小鼠或兔子來產生中和抗體，可這對于快速蔓延的疫情治療而言，顯得非常緩慢。建議使用表達抗體片段的噬菌體或酵母菌展示文庫等更快的方法，這可以很快地用于確定中和病毒的候選先導物。

　　然而，任何抗體的產生都需要在細胞培養和動物模型中進行嚴格測試，以確認抗體能中和2019-nCoV并預防感染。此外，需要對在人群中傳播的幾個分離株進行檢測，以評估中和抗體是否具有足夠的覆蓋度。此外，最終可能需要多種抗體聯合治療，以確保充分保護患者，而這將增加配方的復雜性和制造。在較低等的生物體中（細菌、酵母、昆蟲細胞）表達蛋白將有助于加快對患者的治療。

　　產生針對2019-nCoV S蛋白的中和抗體的另一種策略是用2019-nCoV S蛋白免疫大型動物（綿羊，山羊，牛），然后純化得到多克隆抗體。這種策略可以提供快速治療方案并且具有多種優勢，例如簡化生產和制造，但是并不能保證每種動物都能產生中和性的血清，也不能保證每種動物的抗體效價。此外，還需要考慮人類對針對其他物種產生的免疫球蛋白的免疫反應，這可能會使得任何治療方案復雜化。

　　3. 開發針對2019-nCoV RNA 的寡核苷酸

　　除了靶向2019-nCoV的表面蛋白外，還可以靶向RNA基因組本身進行降解。可以根據最新發表的2019-nCoV的RNA基因組序列（Gen-Bank：MN908947.3）設計小干擾RNA（siRNA）或反義寡核苷酸（ASO）靶向病毒的基因組。

小干擾RNA（siRNA）治療的機制（示例）。

圖源：https://www.grepmed.com/images/411/porphyria-pathophys-therapy-sirna-honc-nejm

　　然而，這一策略面臨多重挑戰。

　　首先，2019-nCoV的保守RNA序列尚不清楚。而識別保守序列是優化siRNA的靶向性和避免病毒逃逸的關鍵。可以通過觀察2019-nCoV與SARS病毒的基因同源性來比較保守序列，但是這仍然只是猜測而已。

　　第二個挑戰是，如何將寡核苷酸送至肺部。脂質納米顆粒等運載體的研究已經取得較大進展，這些運載體可以介導藥物進入肺部組織。然而，目前尚不清楚是否有足夠的siRNA或ASO在肺部發揮作用，以阻止感染或改變其臨床病程。例如，如果肺組織中有25%的肺泡上皮細胞含有siRNA或ASO基因，這種效率在傳統基因治療中已經非常高了，但在病毒感染中幾乎沒有任何作用。

　　這也可能解釋了為什么針對埃博拉病毒的候選siRNA在25次試驗中失敗，盡管在臨床前動物模型中取得了重大成功。最后，即使假設siRNA在臨床上是有效的，將siRNA藥物的生產規模擴大到大量感染人群是不太可能的。目前siRNA和ASO的治療主要針對罕見疾病，沒有現成的資源來快速生產核酸藥物。

　　在2019-nCoV爆發期間，對抗該病毒最簡單、最直接的方法就是采用抗體中和病毒。而由于上面提到的原因，在討論中和抗體時，很難快速驗證廣泛中和的抗體，并面臨一個挑戰，確保變異的RNA病毒不會逃脫抗體的中和作用。

　　然而，還有另一種不依賴于直接作用病毒糖蛋白的策略，即可以通過靶向細胞表達的病毒受體蛋白來獲得中和效果，從而阻止病毒結合并進入細胞。

　　研究已發現，2019-nCoV的細胞受體為血管緊張素轉換酶2（ACE2），該受體也是SARS病毒進入細胞的受體。對于這兩種冠狀病毒都是通過其病毒顆粒S蛋白與ACE2受體結合，接著膜膜融合，病毒RNA釋放進入宿主細胞并利用宿主細胞進行復制，產生新的病毒，分泌出去感染其他細胞。基于SARS與2019-nCoV都采用ACE2受體，而又有幾種潛在的阻斷策略在SARS模型中被證明是有效的，因此，這為2019-nCoV的治療策略提供了新的思路和研究方向。

　　4. 與ACE2受體結合的阻滯劑

　　第一種策略即給患者使用一種與ACE2受體結合的藥物。這種方法的優點為宿主的ACE2蛋白不會發生變化，所以不用擔心藥物的結合。此外，在本次暴發疫情期間，病毒不會發生突變去結合新的宿主受體分子，這種功能結合關系是通過長期的進化而來的。舉個例子，流感病毒每年都會突變以逃避抗體的中和作用，但其總是將細胞表面的唾液酸作為其進入細胞的受體。

　　已知有兩種方法可與ACE2結合。

　　第一種方法，使用來自SARS病毒的S蛋白的受體結合域（RBD），其已被證明是SARS結合ACE2受體的關鍵結構域。該受體結合域由193個氨基酸組成，在體外已經證明其可以有效地阻止SARS進入細胞。有理由認為，SARS的RBD給予患者，從而結合靶細胞的ACE2蛋白，阻止感染的發生（圖1）。同樣，2019-nCoV的RBD也有可能被用于治療。這種方法是假設SARS和2019-nCoV在ACE2上具有相同的結合位點。

　　此外，RBD蛋白可以融合Fc片段，MERS病毒RBD-Fc融合蛋白既能阻止病毒感染細胞的能力，又能增強小鼠對特定病毒的免疫反應。值得注意的是，由于RBD-Fc融合后會與正常細胞結合，因此可將Fc片段與細胞結合部分進行突變進而清除RBD-Fc與正常細胞結合的能力。

　　然而，SARS RBD的使用可能導致人體對SARS蛋白產生免疫反應，最終在2019-nCoV感染期間，人體對SARS和2019-nCoV同時產生免疫應答。最好的方法就是利用2019-nCoV自身同源的RBD來治療。

　　第二種方法，使用一種可與ACE2受體結合的抗體，從而預防2019-nCoV的感染。這種方法在阻止SARS的進入和復制是非常有效的。雖然目前沒有ACE2的抗體序列，但通過雜交瘤單克隆抗體技術可以很快表達出來。

　　此外，細胞本身也會不斷更新ACE2受體，這將影響藥物的給藥頻率。為了解決這個問題，可以在感染的關鍵部位如肺部，通過霧化的方法增加ACE2抗體的治療濃度。然而這種直接與ACE2結合的方式可能會導致肺部組織生理功能發生變化，加重疾病的發生。一項研究發現，SARS RBD與Fc融合蛋白給予小鼠后，其與ACE2結合導致肺泡水腫。

　　這就表明，如果想采用這種策略，最好在感染早期或者作為預防措施來阻止病毒的感染。

圖1 可用于阻止2019-nCoV感染的治療藥物。ACE2主要表達于人體的肺部組織和胃腸道組織。冠狀病毒表面的S蛋白與感染細胞上的ACE2結合，使病毒核酸進入宿主細胞。

　　5. ACE2免疫黏附分子

　　另一種方式，就是設計一類類似抗體的分子，這種分子可以與冠狀病毒本身結合，可表達可溶性的ACE2受體蛋白，其能與2019-nCoV的S蛋白結合進而中和病毒（圖1）。在對SARS病毒研究中發現，這種方法是非常可靠的。可溶性的ACE2受體蛋白可以降低SARS病毒感染細胞的能力。

　　據報道，可溶性ACE2受體蛋白對SARS S蛋白的親和力僅1.7nM，與單抗的親和力相當，而2019-nCoV與ACE2有相似的親和力。為了臨床治療效果，需要將可溶性的ACE2受體蛋白與Fc片段融合（ACE2-Fc），ACE2-Fc既延長了分子半衰期又能招募免疫系統效應分子對抗病毒。之前的體外研究表明，ACE2胞外區與人源IgG1結構域融合形成的分子（ACE2-NN-Ig）能有效的中和SARS病毒，其IC50為2nM。這項研究為ACE2-Fc在體外抑制2019-nCoV提供了有力證據。

　　此種方法的另一個優勢，是可以治療肺炎等疾病。部分患者感染SARS或2019-nCoV后發生肺炎、肺水腫及ARDS等癥狀。病毒通過S蛋白介導ACE2蛋白脫落、降低ACE2蛋白表達進而引起ARDS。已有結果表明，重組ACE2蛋白可通過降低血管緊張素II水平改善急性肺損傷。重組ACE2蛋白還可減少呼吸道合胞病毒（RSV）和H5N1流感感染模型中的ARDS。基于這些臨床前研究，重組人ACE2蛋白已經進入臨床研究，用于治療ARDS的危重癥病人。臨床一期結果表明，rhACE2具有良好的耐受性，對心血管系統無影響。二期臨床結果表明，rhACE2能有效降低Ang（1-8）肽水平而對呼吸系統參數無顯著影響。ACE2-Fc能否緩解2019-nCoV患者的ARDS，還有待觀察。

圖2 ACE2-Fc融合蛋白。ACE2的胞外結構域與免疫球蛋白Fc結合

　　研究表明，ACE2蛋白的18-615氨基酸片段既能結合SARS S蛋白，也能發揮其ACE2轉化肽酶的功能。

　　目前我們還不知道2019-nCoV S蛋白的結構，也不知道其如何與ACE2受體結合，但我們有充分理由推測，SARS病毒利用的ACE2蛋白結構域也能與2019-nCoV結合。而Fc片段的融合大大延長了藥物的半衰期。此外，與之前提到的ACE2阻滯劑不同的是，Fc片段的效應分子功能仍被保留，其能招募樹突狀細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞對抗病毒感染，這有助于更快激活機體抗病毒反應。

圖3. ACE2-Fc融合蛋白的氨基酸序列。

　　ACE2-Fc的蛋白質序列如圖3所示。可以考慮采用不同的人Fc結構域（IgG1，IgG2，IgG3或IgG4）。開發ACE2-Fc蛋白可以作為未來SARS、2019-nCoV、其他新型冠狀病毒任何使用ACE2受體方式進入細胞的病毒的治療方式。此外，可構建冠狀病毒感染的動物模型，評估ACE2-Fc蛋白的治療作用。

　　總之，ACE2-Fc有潛力成為醫療工作者預防和治療2019-nCoV感染所需的中和抗體。如果盡快根據上述序列表達蛋白，ACE2-Fc將在控制疫情過程中起著重要的作用。如果希望研發一個分子既能實現受體阻斷又實現疫苗功能，即可開發2019-nCoV RBD-Fc融合蛋白。