3個全新的HDAC4酶活性底物及其在肌肉萎縮癥中的重要作用

　　組蛋白去乙酰化酶（HDAC, histone deacetylase）是癌癥藥物研發領域的熱點。在人類中存在18種不同的HDAC，可以進一步細分為4類：I類HDAC（HDAC1、2、3和8）主要存在于細胞核中，主要功能是給組蛋白脫乙酰基。II類HDAC進一步分為：IIa類（HDAC4、5、7和9）和IIb類（HDAC6和10）。IV類HDAC11僅在腦，腎和睪丸中表達。III類HDAC與酵母蛋白SIR2相關，使用NAD+而不是常用的酶促共激活劑Zn2+。

　　與傳統的I類HDAC不同，II類HDAC并不是組蛋白脫乙酰基酶。這類HDAC的酶活性區的一個重要氨基酸——酪氨酸（tyrosine）被組氨酸（histidine）取代，因而針對組蛋白的脫乙酰基酶活性比I類HDAC低1000多倍【1】。因此，II類HDAC被普遍認為并不是一個有活性的酶，而是一個結構蛋白，通過結合其他蛋白起作用。一個流行的理論是，II類HDAC可以識別特定氨基酸序列里賴氨酸（lysine）的乙酰基修飾，結合上以后可以招募別的蛋白，比如I類HDAC中的HDAC3。HDAC3可以提供II類HDAC缺失的去乙酰基酶活性，并且還可以繼續結合NCoR/SMRT轉錄共抑制復合物，從而影響基因轉錄。另一個主要理論是，II類HDAC可以結合一些轉錄因子（例如myocyte enhancer factor 2, MEF2），從而抑制這些轉錄因子調控的基因轉錄。然而只是因為II類HDAC對組蛋白的酶活性很低，就認為II類HDAC沒有酶活性的推論是不嚴謹的。質譜分析全細胞蛋白的乙酰基修飾發現有很多蛋白質都可以被乙酰基化。這些蛋白質不僅僅包括細胞核內的蛋白，還包括細胞質和線粒體里的蛋白等。另外，細菌并沒有組蛋白，但是在細菌里，也發現有很多蛋白可以被乙酰基修飾。這些證據都暗示了II類HDAC很有可能還是有酶活性的，底物是與組蛋白不同的其他蛋白質。一個很好的例子就是IIb類HDAC6的底物之一是細胞質中的微管蛋白。然而到目前為止，只有很少的IIa類HDAC的底物被發現，大部分還是通過過表達的方法證明的，并不一定是正常的生理環境下的真正的底物。

　　HDAC4屬于IIa類HDAC，在小鼠骨骼肌中，對多種誘導肌肉萎縮的刺激反應后，HDAC4的表達量會增加。在因為衰老而引起的肌肉萎縮癥中，HDAC4在人類或者小鼠肌肉中的表達量也會增加。HDAC4全身敲除 (constitutive whole body knockout) 的小鼠在出生以后很快因為骨骼發育異常而死亡。組織性特異的HDAC4基因敲除的小鼠的數據顯示HDAC4在正常的生理環境下不是必須的，但是在壓力或者生病的環境下，它會有新的功能。因此，進一步了解疾病狀態下HDAC4的分子靶標可能會開辟新的治療選擇。

　　2019年10月15日，諾華制藥公司美國研發中心的史雋課題組在Cell Reports發表題為HDAC4 Controls Muscle Homeostasis through Deacetylation of Myosin Heavy Chain, PGC-1α, and Hsc70的文章，通過新研發的強效的IIa類HDAC特異的小分子抑制劑，結合基因敲除的手段，發現了三個全新的HDAC4酶底物：肌球蛋白重鏈 (myosin heavy chain isoforms，MyHC)，PGC-1α和熱激蛋白70 (Hsc70)，同時還分析了HDAC4催化這些底物的生理學意義。

　　以前的很多針對IIa類HDAC的研究大部分是通過抑制基因表達的方法來實現的。但是基因不表達，導致整個蛋白表達減少，并不能區分這類蛋白作為酶或者是結構性蛋白的功能。而目前發表的廣譜的HDAC酶活性的小分子抑制劑，例如TSA, vorinostat (也叫SAHA), 其實都只能抑制I類HDAC，對IIa類HDAC基本沒有活性【2】。一個由Tempero Pharmaceuticals開發的叫做叫TMP195的小分子，算是針對IIa類HDAC比較特異的小分子抑制劑，但是它對IIa類HDAC的EC50大約在0.2 μM左右，活性并不很高。為了能夠更好的研究IIa類HDAC的功能，諾華公司研發出一個新穎的IIa類HDAC抑制劑  --NVS-HD1，非常強效，EC50 < 1nM。NVS-HD1的選擇性也很強，對于I類HDAC的EC50 都超過了1 μM。另外的兩個小分子，NVS-HD2和NVS-HD3是同系列化合物的早期的抑制劑。使用這些特異的IIa類HDAC抑制劑，結合傳統的基因knockdown 或者knockout，史雋課題組找到了三個HDAC4 (也可能是別的IIa類HDAC) 的底物。

　　HDAC4可以去除MyHC上的乙酰基。MyHC是導致肌肉收縮的sarcomere的主要成分。抑制 HDAC4可以增加細胞內MyHC的量，并且在細胞和小鼠中抑制由地塞米松（dexamethasone）和神經缺失引起的MyHC的蛋白質損失。一個2010年的報道認為骨骼肌中HDAC4的敲除可以抑制能降解MyHC的E3泛素連接酶MuRF1的基因轉錄，從而預防由于去神經引起的肌肉萎縮【3】。而這篇文章揭示了一種不同的機制  --直接調控MyHC蛋白。HDAC4過表達會導致MyHC的降解，而酶活性缺失的D840N突變體則不能。即使MuRF1過表達后，IIa類HDAC抑制劑也足以阻止MyHC的降解。因而可能的機理是，HDAC4被抑制后，MyHC上的賴氨酸被乙酰化，所以不能被MuRF1加上泛素，也就不會被泛素蛋白體系統降解。MyHC是骨骼肌中的重要蛋白，保持MyHC的蛋白量就可以預防肌肉萎縮，并且保持肌肉收縮功能。

　　相似的機理也適用于HDAC4的另一個底物  --PGC-1α。在肌肉特異性PGC-1α轉基因小鼠中，PGC-1α的mRNA增加了 > 10倍，而蛋白質僅增加?3倍，部分原因是PGC-1α會被很快降解（t1/2?15分鐘）。NVS-HD1不僅可以在細胞中而且可以在大鼠中增加PGC-1α蛋白水平，卻不顯著影響PGC-1α mRNA水平。NVS-HD1增加的PGC-1α蛋白質的量也是?3倍，和轉基因小鼠類似。在失神經的小鼠肌肉中，即使PGC-1α mRNA水平明顯降低，HDAC4敲除或IIa類HDAC抑制劑也能阻止PGC-1α蛋白的減少。抑制所有的 IIa類HDAC比單獨的HDAC4缺失效果更明顯，與細胞內觀察到的PGC-1α可以和所有的IIa類HDAC（I類HDAC不行）直接結合的結果相符合，暗示了IIa類HDAC之間可以互補作用。PGC-1α是代謝和線粒體產生通路中的重要轉錄共激活因子。過表達PGC-1α的小鼠表現出改善的線粒體功能，類似于運動后的變化。因此NVS-HD1可能在線粒體疾病或者其他代謝疾病中發揮重要的作用。

　　這篇文章也發現HDAC4可以和Hsc70直接結合，并且可以去掉Hsc70的第128位賴氨酸的乙酰基修飾。當HDAC4的酶活性被抑制以后，乙酰化的Hsc70就不能很好的結合地塞米松的受體。但是只有與Hsc70和Hsp90結合的地塞米松的受體，才是被完全激活的可以結合地塞米松的狀態。因而IIa類HDAC抑制劑可以抑制地塞米松和受體結合，從而預防由它引起的肌肉萎縮。Hsc70是許多客戶蛋白行使正常功能所必需的分子伴侶，因此其他重要途徑也可能受HDAC4的調節。

　　除此以外，這篇文章還發現HDAC3，MEF2并不能和HDAC4直接結合。IIa類HDAC抑制劑也并沒有影響MEF2調控的基因的表達。以前提出的IIa類HDAC作為結構性蛋白的工作機理似乎在骨骼肌中并不正確。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.023

　　參考文獻

　　1. A. Lahm et al., Unraveling the hidden catalytic activity of vertebrateclass IIa histone deacetylases. Proc NatlAcad Sci U S A 104, 17335-17340(2007).

　　2. J.E. Bradner et al., Chemicalphylogenetics of histone deacetylases. NatChem Biol 6, 238-243 (2010).

　　3. V.Moresi et al., Myogenin and class IIHDACs control neurogenic muscle atrophy by inducing E3 ubiquitin ligases. Cell 143, 35-45 (2010).