Alnylam：從30％到5％，如何降低RNAi療法的肝臟毒性？

　　RNAi療法因為能夠有效靶向普通藥物無法靶向的蛋白而成為醫藥界所關注的醫療手段。但是與其它靶向療法一樣，RNAi療法也會產生脫靶效應，而這些脫靶效應可能造成嚴重的毒副作用。日前，Alnylam Pharmaceuticals公司的研究人員對N-乙酰半乳糖 (GalNAc) 綴合的RNAi 造成肝臟毒副作用的機制進行了詳盡的研究，并且找出降低這種RNAi療法脫靶效應的簡單方案。

RNAi的發現被認為是每十年一次的重大科學突破，它代表了當今生物學和藥物研發領域最有前途和前沿的領域之一。（圖片來源：Alnylam Pharmaceuticals）

　　GalNac能夠與肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 結合并且轉移到細胞內部，因此將GalNac綴合在RNAi 前體的末端能夠促使RNAi前體向肝臟的靶向運送。已有的對RNAi藥物的篩選方法大多聚焦于藥物的療效上，但是臨床試驗結果表明，很多GalNac綴合的RNAi候選藥物可能導致嚴重肝臟毒副作用。因此，了解肝臟毒副作用產生的原因并且修正對RNAi藥物的篩選標準，是開發RNAi療法的生物技術公司需要解決的難題。

　　GalNac綴合的RNAi療法產生肝臟毒副作用的原因可能有以下幾種：

　　RNAi藥物在肝細胞內溶酶體 (endolysosome) 內過度富集而干擾了內溶酶體的正常功能；

　　用于提高RNAi藥物穩定性的化學修飾可能產生毒性；

　　RNAi藥物的脫靶效應。

　　Alnylam公司的研究人員首先通過一系列實驗證明GalNac綴合的RNAi藥物的肝臟毒副作用不是由于上述原因中的第一種和第二種造成的。RNAi 藥物被導入體內時是以20~25個核苷酸的雙鏈RNAi前體的形式存在。這種RNAi前體需要與RNA誘導沉默復合體 (RNA-induced silencing complex，RISC) 結合, 并且被RISC處理后產生反義RNA片段才能行使它干擾mRNA轉譯的作用。

　　研究人員設計出一種RNAi前體，它雖然有和RNAi藥物相同的結構和化學修飾，但是無法被RISC處理產生成熟的反義RNA片段。他們發現這種RNAi前體雖然依然能夠在內溶酶體中富集，但是對肝細胞的毒性大幅度下降。這一結果表明干擾內溶酶體功能不太可能是肝細胞毒性產生的原因。它同時意味著提高RNAi藥物穩定性的化學修飾同樣不太可能是肝細胞毒性產生的原因。因為大部分RNAi前體都沒有被RISC處理，它們依然保留著提高穩定性的化學修飾。

　　對mRNA轉譯的調控可以通過RNAi和microRNA兩種手段來進行。RNAi通過與靶向mRNA的完全序列匹配導致mRNA被降解。而microRNA則通過與靶向mRNA的不完全序列匹配來抑制轉譯或者降低mRNA的穩定性。RNAi療法中產生的反義RNA片段不但可以與靶向mRNA通過完全序列匹配而結合，還可能與其它mRNA通過不完全序列匹配進行結合，從而產生類似于microRNA的轉譯調節效果。實驗結果表明這一脫靶效應恰恰是肝臟毒性產生的原因。那么如何防止RNAi藥物的脫靶效應呢？

　　因為RNAi與mRNA序列的結合是通過完全序列匹配或幾乎完全序列匹配來完成的，所以更改RNAi序列中的一兩個核苷酸對結合效果的影響不大。而microRNA與mRNA的結合是通過不完全序列匹配來完成的，更改其中一兩個核苷酸會導致microRNA無法與靶點序列結合。研究人員利用了RNAi和microRNA與mRNA結合的不同機理，在他們設計的RNAi序列中故意加入了一個無法與任何堿基配對的核苷酸。這一改進對RNAi與原有靶點的結合影響很小，但是大幅度降低了它以microRNA的作用方式調節其它mRNA轉錄的機會。這種改良同時顯著降低了RNAi藥物的肝臟毒性。

　　雖然理論上RNAi療法以microRNA的作用方式產生脫靶效應的風險無法完全排除，但是這項研究開發出的改良RNAi設計策略可能將RNAi療法在臨床試驗中因為肝臟毒性的失敗率從30~40%降低到5%左右。對于開發RNAi療法的生物技術公司來說無疑是值得采納的設計手段。