CEInfinite:全柱成像新技術拓展蛋白質分析無限想象空間

　　【導語】用液相色譜法分離分析多肽或一些小蛋白的方法已經很成熟，但若要分析較大的蛋白質分子，科學和工業界都會選擇電泳技術，比如在生物制藥行業中做提純后蛋白質的分析表征。不過，不管是凝膠電泳還是傳統的毛細管等電聚焦，電泳實驗可真不是好做的，方法開發困難、實驗時間長、重現性差、操作復雜、線性范圍窄等等一系列問題，讓實驗者頭痛不已。從上世紀90年代末開始至今，很多國內外文獻都報道了一種全柱成像毛細管等電聚焦技術，可以突破以上電泳技術的種種極限，并給予蛋白質分析實驗者各種應用和想象的空間。加拿大AES公司推出的CEInfinite型全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀（cIEF-WCID），正是這種新技術的成功商品化應用。近日，小編有幸采訪到AES公司的總裁兼CEO黃鐵民博士和北京綠綿科技有限公司歐陽偉民總經理，他們將為我們詳解CEInfinite在蛋白質分析中的應用，希望對所有關注蛋白質分析的研究者有所幫助……

AES公司總裁兼CEO黃鐵民博士（左）與北京綠綿科技有限公司歐陽偉民總經理（右）合影

CEInfinite 全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀（cIEF-WCID）

全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀（cIEF-WCID）：

不移動已聚焦固定的蛋白質區帶，直接“拍照”檢測

　　談到cIEF-WCID的定義，先得談談IEF和cIEF的由來。

　　名詞解釋：

　　IEF：等電聚焦電泳，iso-electric focusing electrophoresis

　　CE：毛細管電泳，capillary electrophoresis

　　cIEF：毛細管等電聚焦電泳，capillary iso-electric focusing electrophoresis

　　cIEF-WCID：全柱成像毛細管等電聚焦電泳，capillary iso-electric focusing electrophoresis -whole column imaging detection）

　　等電聚焦電泳IEF技術是表征蛋白質及其他生物高分子的一種主要方法。在生物制藥行業，IEF是一種有30年歷史的常規方法，用于生產過程分析、藥物制劑研究分析及最終產品的質量控制分析，最早是用凝膠IEF實現。然而，作為一種重要的蛋白質分析方法，凝膠IEF分析基本上是非自動化的手工操作，分析速度慢、只能半定量。早在70年代末80年代初大家就認識到，如果IEF技術能轉移到分離柱里進行操作，它的分析速度、自動化程度及定量分析的能力就會大大地提高。毛細管為分離柱的IEF方法即毛細管等電聚焦cIEF在1985年被首次報導。它是將帶有兩性基團的樣品、載體兩性電解質、緩沖劑和輔助添加劑的混合物注入毛細管內，當在毛細管兩端加上直流電壓時，載體兩性電解質可以在管內形成一定范圍的pI梯度，樣品組分依據其所帶電性向陰極或陽極泳動，柱內pI值與該組分的等電點（pI）相同時，溶質分子的凈電荷為零，宏觀上該組分將聚集在該點不再進一步遷移，達到使復雜樣品中各組分分離的目的。

　　過去，cIEF方法是用商品通用毛細電泳CE(capillary electrophoresis)儀器來完成的，我們稱之為傳統單點檢測cIEF。起初人們對這種傳統cIEF報有很大希望：因為使用分離柱操作IEF，將會減少樣品用量，大大提高分析速度，實現自動化及定量。科學界內期望cIEF被長期使用凝膠IEF技術的分析人員所接受，進而在生物制藥行業內代替凝膠IEF技術。但是，這些期望沒有實現。究其原因，主要是用通用CE儀器來做傳統單點檢測cIEF方法有很多不可克服的困難。

　　傳統單點檢測cIEF的主要問題是移動過程(mobilization process)。在IEF聚焦過程結束時，各蛋白質組份都已在毛細管內形成不移動的窄區段。但由于通用CE儀器的檢測器都是單點檢測器，用這種儀器去檢測那些不動的蛋白質區段就要有一個移動的過程——把這些已經聚焦好、固定好的蛋白質區段，再推到單點檢測器的檢測點。傳統單點檢測cIEF技術的困難與麻煩都是來自這個移動過程。凝膠IEF雖然沒有這個過程，但產生的最大問題是分辨率差，方法優化麻煩，分離時間長及重現性不好。

　　那么，是否可以開發一種既利用了毛細管等電聚焦電泳高速、高分離度的特點，又能直接檢測已固定聚焦好的蛋白區段的技術？

　　這時，人們會想到“照相”，透過毛細管，對這些聚焦好的區段直接拍照不就行了？

　　不過，真正設計成儀器，就得考慮透過毛細管拍照的速度、靈敏度、線性范圍、實際操控的方便性、穩定重現性等等一系列問題。

　　終于，CEInfinite型全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀cIEF-WCID（whole column imaging detection）橫空出世，它是電荷耦合裝置 (CCD) 成像技術和微分離技術發展到一定高度后的產物，CEInfinite利用更為先進的CMOS成像技術對整個微分離通道（長度通常為3-8厘米）內的分離進行成像檢測，檢測信號可以是紫外吸收、折射指數梯度或激光誘導熒光。

單點檢測毛細管電泳原理圖：將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。依據遷移時間確定樣品，利用朗伯-比爾定律對樣品進行定量。但是普通毛細管電泳分離能力較弱、分析時間長、對PH值要求高，且重現性差。

全柱成像毛細管電泳技術的原理圖：在高壓下，樣品通過具有涂層柱的毛細管，根據蛋白質pl點的不同在毛細管內聚焦，CMOS照相機可以直接檢測不同蛋白質的pl點。撤掉電壓后，樣品峰經過擴散，利用朗伯-比爾定律可對樣品進行定量，并可進行分子量測量、或對分子間相互作用進行研究。

CEInfinite型cIEF-WCID和傳統單點檢測cIEF、凝膠IEF的比較

分析速度：遠遠超過其它技術

　　在蛋白質pI點測定這個最核心的傳統項目上，CEInfinite cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）耗時小于10分鐘，傳統單點檢測cIEF 45分鐘，凝膠IEF 400分鐘。

cIEF-WCID （紅色）； 傳統單點檢測cIEF（cIEF，綠色）和凝膠等電聚焦（Gel IEF，蘭色）的分析時間比較

全面比較：CEInfinite處處領先

 

	凝膠IEF	傳統單點檢測cIEF	CEInfinite cIEF-WCID
實驗難度	高	低	低
自動化	不行	可以	可以
pI測定和峰鑒定	不準確	準確	準確
定量	不行	可以	可以
分辨率	很差	較好	極佳
重復性	很差	還可以	非常好
pI范圍	窄	寬	非常寬
方法運行時間	非常長 400分鐘	長 45分鐘	短, 小于10分鐘
方法開發時間	非常長	長	短

與傳統單點檢測cIEF的技術細節比較

　　原理上，兩者的區別很大；在實際的技術細節上，CEInfinite也顯示出強大的優勢。

與凝膠IEF比較——更快、更省、更人性化

　　黃博士表示：“凝膠電泳是最傳統的技術，需要的分離時間長，需要大量的人力物力，也需要消耗大量的消耗品，它的結果只能是半定量，不能完全定量，而且不能實現自動化。而CEInifinite全柱成像毛細管等電聚焦電泳保持了凝膠電泳直觀和高分辨率；具有快速，自動，定量的特征；方法建立簡單，重復性好，檢測線性范圍寬；還具有成像檢測獨有的多參數分析。”

　　“目前，我們已利用微流控技術，將CEInfinite和質譜聯用。可以擺脫傳統雙向凝膠電泳和質譜分析技術在離線分離分析方面的種種困擾，并解決傳統單點聚焦CE-MS聯用的種種歷史遺留問題，大大推動蛋白質組學、生物醫藥研發等領域的發展。”黃博士興奮地表示。

CE-WCID的技術優勢

CMOS照相機——檢測整個分離通道內的各組分的動態變化

　　CEInfinite采用照相機CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Translator，互補性金屬氧化物半導體)作為成像檢測技術，代替了傳統的CCD成像技術，具有高速數據采集、寬線性范圍、綠色節能、超高檢測靈敏度和和儀器穩定性等優勢，這是其成為蛋白質分析的黃金技術和工業標準的重要基礎。

　　擁有最全的pI標記物和CEInfinite兩性pH載體

　　所謂好馬配好鞍，做好cIEF-WCID全柱成像毛細管等電聚焦電泳實驗，除了好儀器，還要有好配套。和CEInfinite系統配套的是：

　　（1）目前世界上最全的pI標記物(pI Marker)：30種pI Marker(pI點范圍：2.8 ~11)；相當于給CEInfinite提供了準確的刻度尺，保證每次實驗的準確、精確。

　　（2）最完善的pH載體(carrier ampholytes)：四種ZL化獨有的Aeslytes pH 3-10、Aeslytes pH 2.5-5、Aeslytes pH 5-8 和Aeslytes pH 8-10.5，并可以根據客戶需要定制高分辨的pH范圍。相當于提供了4種量程，大大方便實驗的操作、提高分析速度和質量。

AESZL化合成的高準確度和高化學穩定的pI Marker

CEInfinite Aeslytes 超高分辨率的pH 載體 (與其它商品化的pH 載體相比，具有更高的pI分辨率和穩定性)

,

出色的重復性和超高分辨率

　　CE-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）具有超高的蛋白質pI點的分辨率(△pI<0.01)，這個指標無人能比。

蛋白質pl點的測定舉例：△pI<0.01，7分鐘完成實驗

　　蛋白質藥物主要成分和降解產物的pl點測定和重復性的考查

　　CE-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）連續50自動進樣分析出色重復性、高分辨率和準確的pI點測定

 “一機多用”

　　CEInfinite是多種蛋白分析表征儀器的結合體，一種設備承擔了多種分析的能力，它是蛋白質分離分析儀、是pl測定儀、是分子量和擴散系 數測定儀、是蛋白質相互作用表征儀。一種儀器、一種分析模式就能完成所有蛋白分析的整體應用和表征，甚至一次分析能獲得多種應用結果。而傳統CE必須通過 復雜的操作機理完成不同的應用，實用性很差。

強大的自動進樣系統(Alcotte719)和數據處理軟件

高通量、自動化和功能強大的數據采集和處理軟件

　　CEInfinite擁有超高穩定性的自動進樣系統(Alcotte719)和功能強大的操作和數據處理軟件，具有自動數據匹配、pI值自動軟件計算等功能；

穩定的CEInfinite涂層柱

CEInfinite涂層柱

　　完善和多樣化的涂層毛細管Cartridge，極大提高了蛋白質分離的靈敏度和分辨率。毛細管Cartridge上具有高穩定性的涂層，極大提 高了有效使用時間；涂層具有化學惰性，無需清洗，可連續使用，且對樣品添加親水聚合物無要求。如果橫向比較的話，一根色譜柱有多長使用壽 命，CEInifinite提供的涂層毛細管柱就有多長壽命。

高性能CEInfinite分離柱盒

　　CEInifinite具有專有的高性能分離柱盒，其上集成了散熱片，具有合適的光學狹縫，保證高檢測線性范圍；專有膜技術保證重復和高速進樣的能力。

CEInfinite：拓展蛋白質分析無限想象空間

一、蛋白質pI的測定：黃金技術和工業標準

　　CEInifinite可直接、準確、快速的蛋白質 pI點測定：分析時間小于10 分鐘，分辨率△pI<0.01，測定準確而且重復性出色，常規方法難以與其相比擬。在生物制藥行業，可用于生產過程分析、藥物制劑研究分析及最終產 品的質量控制。在生物藥品制品的法規檢測部門，CEInfinite同樣將發揮巨大潛力，因為它對操作人員的要求不高，實驗非常準確快速，便于方法推廣和 法規監督的落地執行。

　　參考：蛋白質pI的測定應用

二、蛋白質分子量和擴散系數的測定：一次實驗實現2D分離

　　CEInfinite除了可以根據蛋白質等電點不同進行快速分離和定量，接下來可以用峰參數直接計算擴散系數和分子量大小，而且一次實驗就可以 完成。傳統上，這種工作時由雙向凝膠電泳完成的，第一維在固定化膠條上使蛋白質按等電點分離并固定；然后在第二維SDS-PAGE上，按照分子量分離蛋白 質；然后用掃描儀檢測；最后用軟件分析。雙向凝膠電泳的整個實驗耗時需幾天。而且由于步驟中間有樣品轉移等過程，多次實驗的重現性一直都是一個難題。

　　黃博士當場演示了混合蛋白質的分離聚焦檢測，以及讓其擴散后通過測定擴散系數來計算分子量的實驗。整個實驗只做一次，得到各個蛋白的pI點和分子量，耗時不到1個小時，結果是非常令人震驚的！

　　CEInifinite已經可以實現和質譜聯用，希望和客戶進行高水平的合作，并且用激光誘導熒光檢測技術進一步提高CEInfinite的靈敏度，可以預計，cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）技術未來將對蛋白質組學、生物制藥研發領域產生巨大的影響。

　　參考：蛋白質分子量和擴散系數測定的應用

　　          蛋白質和生物分析分子量和擴散系數表征的應用

三、蛋白質分析研究和質控的利器：

純度檢測、質控、穩定性研究、蛋白定量、食品安全、植物生理學和功能性蛋白的監控、真偽鑒別

　　在生物制藥行業運用CEInfinite，可方便地對蛋白質藥物在貯存0-6月時，進行穩定性考查及其純度測定，能夠快速準確測定酸性/堿性降解蛋白的pI值；還可以應用于蛋白質藥物主成分、以及酸性/堿性降解產物的 pI 點測定和純度考察。

　　參考：蛋白質分離、純度檢測和定量分析的應用

　　CEInfinite還可進行蛋白質和抗體藥物的穩定性研究，這對于新藥研發和質控有重要意義。比如研究Hb A0 溶液(10μmol/L)在37oC放置3天的穩定性，和蛋白質藥物在酸性條件下（pH<7.0）的穩定性。

　　參考：蛋白質穩定性研究的應用

　　CEInfinite是蛋白質藥物和抗體藥物和工藝研究的強有力手段，能夠表征不同的抗體藥物和治療性蛋白質藥物的成分，為質控和工藝研究提供基礎性研究數據。

　　參考：蛋白質藥物和抗體藥物的質量控制和工藝研究

　　黃博士講到的CEInfinite在食品安全等領域的應用非常吸引人。他說：“三聚氰胺事件反映的是，國家標準中測定的是總氮含量，而不是原來 的蛋白質含量，這就給作假造成了可趁之機。很多蛋白產品（比如奶粉、嬰幼兒奶粉、膠原蛋白）等的質控，用液相色譜法都很難，樣品需酶解為多肽才能檢測，這 樣就又在分析中引入了新的化合物，而且檢測的不是原來的蛋白質。

　　而用CEInfinite，可以快速、高分辨地、直接測定混合物中的蛋白質，包括pI點和分子量等多個參數，可以應用于特征蛋白質標志物的定性 定量監控，或獲得多種蛋白混合物的指紋圖譜。我們非常希望跟各位科學工作者合作，開發一些方法，為中國的食品安全、蛋白藥物、功能性蛋白產品的質量控制和 安全做出貢獻。

　　參考：食品安全、植物生理學和功能性蛋白的監測和控制

四、蛋白質和其它分子的相互作用研究

　　黃博士談到該應用的前景也興致盎然：“一談到蛋白質和其它分子的相互作用，大家常會想到GE Healthcare的Biacore。”由于CEInfinite cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）的高分辨率、快速分析等特點，可以實時地觀察到蛋白質在分離柱內的各種動態的變化，實時觀察蛋白質與其它分子結合的產生、變化、結束等 各個過程，在蛋白質和其它分子相互作用。許多科學家們也發表了大量文獻，介紹用全柱成像毛細管等電聚焦技術來研究蛋白質和其它分子的相互作用。“未來我們 還將根據科學家關注的方向，發展更多的配套方法、軟件等，來支持在蛋白質相互作用領域的各種創新性研究。非常歡迎各位應用科學家們給我們指出 CEInfinite更多的應用構想。”

　　這里，舉例了一些可能的研究方法，如：利用CEInfinite動態檢測蛋白質和抗體藥物的聚焦過程，直接和動態監控生物大分子、蛋白質-藥物之間的相互作用，從而研究其功能和活性機制。

　　比如：用CEInfinite研究Ab-Ag相互作用，其復合物能夠被高分辨測定，相互作用能夠被動態表征；研究人血紅蛋白A0和順鉑類抗癌藥物Cisplatin的相互作用；動態監測胰蛋白酶抑制劑–PC/PS(8:2,mol%) 的相互作用；研究Ca2+和磷酸化酶b的相互作用；動態研究蛋白質-DNA的相互作用及其復合物的形成。

　　參考: 蛋白質的生物相互作用研究的應用

         　　蛋白質結構研究的應用

　         　臨床化學的應用

　　綠綿科技的總經理歐陽偉民先生表示：“全柱成像毛細管電泳技術在中國市場將有非常廣泛的應用。目前主要應用在生物藥的質控，在蛋白質基礎研究上也有廣泛的應用前景，如細胞株的篩選、蛋白質構象、蛋白質與藥物相互作用、蛋白質與金屬離子相互作用、蛋白質之間相互作用等等。同時在食品中功能蛋白的分析也有非常大的市場潛力，綠綿科技也做了一些基礎的實驗，如肉類的摻假、奶制品的乳清蛋白和酪蛋白的分析、育種分析等。隨著方法的進一步完善，將來 clEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）在這些領域的應用潛力非常巨大。”

CEInifinite的獨有技術

　　談到CEInfinite的獨門絕技，還得先談談黃鐵民博士本人以及2010年成立的AES公司。

　　1997~2003年，黃博士在加拿大滑鐵盧大學讀研究生期間，便開始從事全柱成像毛細管等電聚焦電泳技術相關理論的研究工作，并獲得了熒光檢測和全柱檢測的ZL；并在2010年創辦了AES公司（Advanced Electrophoresis Solutions Ltd ）。

　　據黃博士介紹，早在10年前，他本人就參與編寫了三部手冊介紹cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）技術，并前后發表了50余篇應用文章。

　　CEInifite發展了更多新的應用和技術，比如除pI測定外，還可進行蛋白質分子量的測定和蛋白質相互作用的研究；CEInfinite上可配置激光誘導熒光檢測器，將具有更高的靈敏度。

在中國的發展

　　談到在中國未來的發展，黃博士表示：“cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）技術在中國將有很好的發展前景，近期相比歐美國家還將有發展優勢，這與中國整體的經濟 發展和科技發展的現狀有關。近年來歐美經濟的發展遇到了很大的困難，實驗室沒有很大的動力改變原有的檢測方法體系；而中國很多方法都在新建中，更容易直接 采用新技術。如臨床、食品和新藥開發上的很多應用方法，中國都正在建立之中；而國外很多檢測方法早已建立好，沒有更多的動力去做新的方法。所以，現在有意 愿進行這些科研、并有經濟能力和人才去使用新的cIEF-WCID技術的實驗室更多將在中國。”

　　“如果我們更努力推廣，與更多的實驗室合作，使用cIEF-WCID（全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀）技術建立的方法還有望成為一些新的標準，因為cIEF-WCID的顯著特點 是高效、節能。如貧血時的驗血，用cIEF-WCID五分鐘就可以完成了，而高效液相需要一個小時才能完成。所以，一般的醫院也可以高效、快速地驗血了， 解決了一般人看病難的問題。”

　　“cIEF-WCID先進的技術會讓研究者們發現很多傳統技術發現不了的東西，將會促進中國的科研水平大幅提高。”黃博士自信地說，“兩性載體 是上個世紀七八十年代在歐洲發展起來的，但是后來一直都沒有成功應用到傳統的毛細管電泳中，現在我們將兩性載體的技術應用到更先進的CEInfinite cIEF-WCID儀器中，如果中國更快使用這種更先進的儀器，會在該領域更快地步入全球該領域的科技前沿。我本人當然非常愿意花更多的精力支持中國的發 展。”

clEF-WCID應用價值高，綠綿科技對此新技術充滿信心

　　AES公司cIEF-WCID產品在中國的總代理、綠綿科技的歐陽偉民總經理表示：“綠綿科技一直關注行業先進技術的發展，致力于先進技術的傳 播和推廣，希望先進技術能更好的服務社會，全柱成像毛細管電泳技術（clEF-WCID）就是近幾年來公司關注的創新技術。clEF-WCID的高效、快 速、高分辨能力為生物藥物分析提供了新手段，同時，結合我們對行業的經驗和對全柱成像毛細管電泳技術的了解，cIEF-WCID還可應用到食品安全、農業 育種、臨床檢驗等領域。這些應用都將非常符合中國的發展需求，我們非常看重此技術的應用價值。”

　　關于AES公司的總裁兼CEO黃鐵民博士的簡介：Resume_Tiemin