CRISPR的優勢分析

時至今日，很多研究者仍著迷于研究細菌CRISPR系統的功能，以及如何借助對相關機制的理解來產生新的技術。CRISPR系統目前在臨床診斷與基因療法中的研究成果也在不斷涌出。近日，Sherlock Biosciences公司宣布其基于CRISPR技術的新冠病毒試劑盒已獲得美國FDA的緊急使用授權。這是FDA首次批準基于CRISPR基因編輯技術的新冠病毒檢測產品，也是首次授權使用CRISPR技術進行傳染病檢測。

一、CRISPR-Cas是細菌體內精妙的防護系統

CRISPR的全名是“規則間隔簇狀的短回文重復序列”，最初在研究者細菌和古細菌的DNA中發現了這些序列，大小范圍為23-47個堿基對。這些重復序列（repeat）被相似長度的間隔子（spacer）隔開。

Repeat是細菌固有序列，能夠同時結合CRISPR相關性（Cas）蛋白和spacer序列，而spacer則是細菌（或是其祖先）感染過的病毒序列。一旦病毒感染發生，絕大多數的細菌死亡，極少部分的細菌由于其基因變異得以生存。這些細菌中的一部分，將病毒的DNA序列切割后，插入repeat區域中，形成spacer，從而獲得類似高等生物“免疫記憶”的能力。當細菌被病毒再次攻擊時，這些間隔序列會從整個序列排列中被轉錄出來，切割成為成熟的crRNA對Cas蛋白的復合物進行引導，切割病毒的核酸分子中的間隔序列前體（protospacer）。

crRNA招募效應蛋白的組成將其分為兩級，1級CRISPR系統利用多個Cas蛋白與crRNA形成效應復合物，2級CRISPR系統利用單個大Cas蛋白與crRNA形成效應復合物。

需要注意的是，只有當間隔序列前體的兩側是由間隔序列前體臨近基序（PAM）組成時才會發生切割，而在間隔序列兩側沒有PAMs時不會發生。不同的Cas蛋白識別不同的PAM序列，有研究表明產膿型鏈球菌（Streptococcuspyogenes）中的SpCas9對病毒基因組的切割作用需要在病毒性序列作用目標下游有一個5'-NGG-3'間隔序列前體臨近基序（PAM）序列的存在。

總而言之，CRISPR-Cas系統是一種RNA介導的適應性免疫系統。整個過程有點類似慕容復的“以彼之道，還施彼身”，你用DNA對付我，我用你的DNA把你殺死。

二、CRISPR-Cas臨床診斷優勢凸顯

利用CRISPR酶的酶切特性，分子診斷技術有望在兩個方向實現突破：一是對多種病原體實現高靈敏度定量檢測；二是快速診斷，減少檢測時間。Gootenberg等開發了一種改進的核酸檢測技術，用于多重定量和高度靈敏的檢測，并結合了側向層析技術對核酸檢測結果進行可視化。Myhrvold等通過添加樣品制備方案，以快速檢測臨床樣品中的特定病原體。

2016年，國內最有名的張鋒實驗室團隊發現Cas13在單個crRNA的引導下，能夠切割ssRNA或mRNA（類似于RNA干擾），實現基因敲低方面的應用。同時，Cas13還附帶非特異性的ssRNA切割功能。其開發的SHERLOCK v1版方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬滅的ssRNA報告基團 ，通過等溫擴增步驟來快速檢測單個DNA或RNA分子。

2018年，張鋒實驗室團隊的成果用簡單的紙帶（paper strip），以展示基因特征（genetic signatures）的測試結果。將紙帶浸入處理過的樣本后，會出現一條線，指示著目標分子是否被檢測到了。通過對CRISPR酶學的表征和應用開發，實現了更快速、更靈敏的檢測：1、檢測下限低至2 attomolar；2、通過將Cas13與Csm6（一種與CRISPR相關的輔助酶）結合，使信號靈敏度提高3.5倍；3、SHERLOCK v2可以通過側向層析檢測登革熱或Zika病毒單鏈RNA以及患者液體活檢樣品中的突變，突出了其作為核酸的可復用，便攜式，快速和定量檢測平臺的潛力。

2018年4月，另一個知名團隊Jennifer Doudna教授發現Cas12酶家族在gRNA的引導下與目標序列結合以后，便會切換為激活狀態切割體系內其它的單鏈DNA（如含有報告基因的單鏈底物）。Cas12a這一特點可被用于分子診斷領域，實現對腫瘤基因或特定病原體的檢測。Doudna教授將Cas12a靶向切割單鏈DNA的特性與重組聚合酶擴增RPA技術聯合起。當加熱到體溫時，RPA會快速增加目標DNA的拷貝數，使Cas12a更容易找到并切割它，然后任意切割附近單鏈DNA，從而讓報告分子發出熒光。

Doudna教授為了分析DETECTR方法的特異性和靈敏度，測試了25種人類肛門拭子的DNA提取物，這些樣本先前已通過基于聚合酶鏈反應（PCR）的方法進行過HPV感染分析。在1小時內，DETECTR準確地鑒定了包含HPV類型異質混合物的患者樣品中的HPV16（25/25）和HPV18（23/25），PCR結果與DETECTR熒光信號之間具有良好的相關性。這些結果證明了一種新的基于CRISPR的診斷平臺，類似于使用CRISPR-Cas13a用于RNA檢測的平臺，并表明DETECTR原則上可以以高靈敏度和特異性檢測任何DNA序列。

較為明顯的是，RT-PCR的檢測一般要等幾個小時，還需要使用特殊設備、進行冷熱循環；與之相比，DETECTR以及SHERLOCK v2技術只有兩個固定的操作溫度，大約45分鐘后，就能像家用驗孕測試一樣，在可視化讀出條上讀取結果。具有良好的應用前景。

三、CRISPR與罕見基因病療法

除了在臨床分子診斷領域的應用，CRISPR基因編輯技術已應用于白血病、血友病等遺傳病的基因療法（gene therapy）取得多項進展。基因治療是將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，達到治療目的。目的基因轉移方法可分為病毒方法和非病毒方法兩大類。由于CRISPR/Cas9基因編輯技術能作為向導把目的DNA送達靶位置，避免對正常功能基因的干擾，可減少不必要的突變風險。目前這項面臨的主要挑戰是將它送到體內的正確位置。

市場上主要的專注于基因編輯的3家上市公司為Editas Medicine、 CRISPR Therapeutics和Intellia Therapeutics，多家創業公司融資到B輪。但CRISPR基因編輯的發展并非一帆風順。2018年5月，CRISPR Therapeutics公司與Vertex Pharmaceuticals的合作遭遇挫折，其共同研發的針對鐮刀型貧血癥的基因療法CTX001在FDA的IND審查中受到臨床試驗暫停。近日獲得進展，于 5 月 11 日宣布，（FDA）授予 CTX001 再生醫學高級療法（RMAT）資格，CTX001 是基于CRISPR研發出的一種研究性，自體基因編輯的造血干細胞療法，將用于治療嚴重的嚴重鐮刀型細胞貧血病（SCD）和輸血依賴性β地中海貧血（TDT）。

主要問題是由于目前廣泛用于基因組編輯的CRISPR / Cas9方法涉及切割兩條DNA鏈，在目標DNA序列中形成雙鏈斷裂。當用于糾正單個核苷酸時，會經常在目標位置引入隨機插入或缺失（統稱為indels）。消息一出，3家上市公司的股價均受到嚴重挫折。為了解決這個問題，David Liu及其同事的研究對Cas9蛋白進行了修飾，使其不再切割兩條DNA鏈，但仍可以與目標DNA序列結合。通過將堿基修飾酶（APOBEC1）連接到Cas9，能夠將胞嘧啶（C）直接轉化為尿嘧啶（U），尿嘧啶（U）與胸腺嘧啶（T）形成堿基對。

結語

我們非常可喜地看到，CRISPR技術在臨床感染診斷，液體活檢和基因治療方面都取得了不錯的進展。如何能讓CRISPR技術這把神奇的基因剪刀手變得準確率更高、編輯更有效，是CRISPR技術發展的主要方向。