CRISPR技術再升級——單堿基的精準編輯

發布時間：2018-08-08 14:30 原文鏈接： CRISPR技術再升級——單堿基的精準編輯

　　CRISPR/Cas9基因組編輯系統來源于簡單的細菌免疫系統組分，經過改造后可在真核細胞中實現高度靈活且特異的基因組編輯。該系統是單RNA(single-guide RNA, sgRNA) 介導的核酸酶系統，通過靶點特異的CRISPR RNA (crRNA)序列與靶序列進行堿基配對從而引導Cas9蛋白至特定的切割位點進行切割，然后通過經典的非同源性末端接合 (NHEJ) 或同源重組 (HDR) 對斷裂的DNA進行修復。然而，NHEJ修復會造成核酸的插入或者缺失(Indel), 產生顯性負效應突變或者新抗原表位的風險。雖然HDR修復精確度高，然而HDR修復效率極低且局限于有絲分裂細胞，限制了HDR修復的應用。因此，精準修復致病基因點突變依然是一大難題。

　　美國哈佛大學David R. Liu課題組發表在《Nature》的” Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”論文創新性的開發了基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器（base editor, BE），有效地解決了上述問題。

　　該研究組將胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U）的大鼠胞嘧啶核苷脫氨酶rAPOBEC1通過linker序列XTEN連接到催化失活Cas9（catalytically dead Cas9, dCas9）N端，構建出了第一代單堿基編輯器base editor (BE1)（rAPOBEC1–XTEN–dCas9）（圖一）。

圖一

　　運用BE1進行體外實驗表明目標C堿基5端是G堿基時編輯效率顯著降低，BEI編輯效率遵循TC ≥ CC ≥ AC > GC (C為目標堿基)原則，此外目標C堿基位于sgRNA的第7位或者附近時編輯效率最高（圖二）。體外細胞實驗研究表明，運用BE1可以使C→T的編輯效率達到0.8% -7.7%（圖三）。

圖二

　　鑒于BE1的單堿基編輯效率較低，研究者們認為有可能是BE1編輯使CG堿基對轉換成UG堿基對，然而正常細胞會將UG識別為錯配堿基對，從而啟動體內尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA glycosylase, UDG）識別U并將其切除，進而將其重新修復為CG。因此在BE1的基礎上，研究者們又融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI），構建出了第二代單堿基編輯器BE2（rAPOBEC1–XTEN–dCas9-UGI）。實驗結果表明BE2編輯效率是BE1的3倍（圖三）。

　　BE2編輯過程中只改變了CG堿基對中的C堿，因此其理論上C→T的最大轉換效率只能達到50%。為了進一步提高編輯效率，研究者們部分恢復BE2編輯器中Cas9的切割活性（dCas9-(A840H)），構建出了第三代單堿基編輯器BE3（rAPOBEC–XTEN–dCas9(A840H)–UGI）。BE3中的Cas9可以切割包含G堿基的非編輯DNA單鏈，斷裂后的非編輯鏈（G所在鏈）會以編輯鏈（T所在鏈）為修復模板進行修復，因此理論上C→T的轉換效率可以達到100%，即CG可以完全轉換為TA。研究結果表明BE3編輯效率是BE1的2-6倍（圖三）。

圖三

　　最后，研究者們運用BE3對致病突變修復進行了研究。在體外細胞系的試驗發現BE3對阿爾茨海默病致病基因APOE4的改造效率可以高達74.9%，對癌癥相關致病基因TP53的改造效率為7.6%，而indel率維持在較低水平（4.6%及0.7%）（圖四）。

　　BE3單堿基編輯技術的出現為真正意義上的單堿基（T→C, A→G）致病突變基因的精準修復提供可能。

圖四