Cell：我國科學家揭示SARSCoV2利用人ACE2進入細胞機制

　　-新出現和重新出現的病毒是對全球公共衛生的重大威脅。自2019年底以來，中國政府已在中國武漢市報告了一系列人類肺炎病例，這種疾病被命名為2019年冠狀病毒病（COVID-19）。這些病例表現出諸如發燒和呼吸困難之類的癥狀，并被診斷為病毒性肺炎。全基因組測序結果顯示病原體是一種新型冠狀病毒，最初被世界衛生組織（WHO）命名為2019-nCoV。隨后，國際病毒分類學委員會正式將這種病毒命名為SARS-CoV-2，不過許多病毒學家認為HCoV-19更合適。

　　SARS-CoV-2代表著已知會引起人類疾病的第七種冠狀病毒。冠狀病毒是一類較大的有包膜的病毒，具有正向的單鏈RNA基因組。冠狀病毒可分為四個屬，即α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒。先前確定的可導致人類疾病的人類冠狀病毒包括屬于α冠狀病毒的 hCoV-NL63和hCoV-229E以及屬于β冠狀病毒的HCoV-OC43、HKU1、嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征（MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）。

　　α冠狀病毒以及β冠狀病毒HCoV-OC43和HKU1均會引起自限性的普通感冒樣疾病。但是，SARS-CoV和MERS-CoV感染可導致威脅生命的疾病并具有大流行的潛力。在2002年至2003年期間，SARS-CoV在全世界造成8000多例感染和大約800例相關死亡。2012年，MERS-CoV首次在中東發現，然后傳播到其他國家。截至2019年11月，全球27個國家共記錄了2494例MERS病例，其中858例相關死亡。值得注意的是，最近仍在報道感染人類的MERS-CoV的新病例。SARS-CoV和MERS-CoV都是源自動物的人畜共患病原體。詳細的研究表明SARS-CoV是從果子貍傳播給人類的，而MERS-CoV是從單峰駱駝傳播給人類的。然而，SARS-CoV-2的來源仍在調查中，但與一家濕動物市場有關。

　　病毒感染始于病毒顆粒與宿主表面細胞受體的結合。因此，受體識別是病毒的細胞和組織嗜性（tropism）的一個重要決定因素。此外，病毒結合其他物種的相應受體的功能獲得也是物種間傳播的先決條件。有趣的是，除了HCoV-OC43和HKU1均與糖分子結合從而與細胞附著外，其他的四個人類冠狀病毒均將蛋白肽酶識別為受體。HCoV-229E與人氨基肽酶N（hAPN）結合，而MERS-CoV與人二肽基肽酶4（hDPP4或hCD26）相互作用。盡管SARS-CoV和hCoV-NL63屬于不同的冠狀病毒屬，但是它們均與人類血管緊張素轉化酶2（hACE2，即人ACE2）相互作用以進入宿主細胞。在COVID-19疫情爆發后，中國科學家迅速確定SARS-CoV-2也利用hACE2進入細胞。

　　在冠狀病毒中，這種進入過程是由嵌入包膜的位于病毒表面的刺突糖蛋白（S蛋白）介導的。在大多數情況下，S蛋白會被宿主蛋白酶切割為分別負責受體識別和膜融合的S1和S2亞基。 S1可以進一步分為N末端結構域（NTD）和C末端結構域（CTD），兩者都可以充當受體結合實體（比如，SARS-CoV和MERS-CoV都利用S1 CTD識別受體，因而稱為受體結合結構域（RBD），然而小鼠肝炎冠狀病毒利用它的S1 NTD與受體結合。在此之前，SARS-CoV-2 S蛋白中負責與hACE2相互作用的區域仍然是未知的。

　　在一項新的研究中，來自中國科學院、深圳市第三人民醫院、山西農業大學、安徽大學、四川大學、中國科技大學和香港大學的研究人員利用免疫染色和流式細胞儀測定技術，首先鑒定出S1 CTD（SARS-CoV-2-CTD）是SARS-CoV-2中與hACE2受體相互作用的關鍵區域。他們隨后解析出SARS-CoV-2-CTD與hACE2結合在一起時的分辨率為2.5 ?的晶體結構，揭示了一種整體上與SARS-CoV RBD（下稱SARS-RBD）相類似的受體結合模式。但是，與SARS-RBD相比，SARS-CoV-2-CTD與hACE2形成更多的原子相互作用，這與顯示更高的受體結合親和力的數據相關。相關研究結果以論文手稿的形式在線發表在Cell期刊上，論文標題為“Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human ACE2”。

圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.03.045。

　　值得注意的是，一組單克隆抗體（mAb）以及針對SARS-S1/RBD的鼠多克隆抗血清無法與SARS-CoV-2 S蛋白結合，這表明SARS-CoV和SARS-CoV在抗原性上存在顯著差異，并且提示著先前開發的基于SARS-RBD的候選疫苗不太可能對SARS-CoV-2預防有任何臨床益處。

　　中國最近出現了SARS-CoV-2感染，這引起了重大的公共衛生問題。據報道，hACE2是這種新型冠狀病毒的受體。在這項新的研究中，這些研究人員確定了SARS-CoV-2中與這種受體相互作用的關鍵區域，并解析出SARS-CoV-2-CTD與hACE2形成復合物時的晶體結構。

　　將這種新鑒定出的SARS-CoV-2考慮在內，迄今為止已報告了七種人類冠狀病毒。在這些人類冠狀病毒中，三種（hCoV-NL63，SARS-CoV和SARS-CoV-2）已被證實利用hACE2受體進入宿主細胞。先前已經報道了hCoV-NL63 CTD和SARS-RBD與hACE2結合在一起時的復雜結構。盡管hCoV-NL63 CTD和SARS-RBD在結構上截然不同，但是這兩種病毒配體識別并結合這種受體的位點存在空間重疊。 SARS-CoV-2-CTD與hACE2結合在一起時的復雜結構揭示了SARS-CoV-2在hACE2中的大多數結合位點也與SARS-CoV結合位點重疊。這些觀察結果支持這些冠狀病毒進化為識別hACE2中的“熱點（hot-spot）”區域以結合這種受體。

　　據這篇論文手稿的修訂版，人們已報道在低溫電鏡（cryo-EM）分析中，全長hACE2結構在B0AT1（一種氨基酸轉運蛋白）的存在下形成了二聚體。他們還報道了二聚體hACE2-B0AT1與兩個SARS-CoV-2-CTD結合在一起時的的低溫電鏡結構，每個SARS-CoV-2-CTD分子與一個hACE2單體結合，結合界面處的局部分辨率為3.5 ?。這項新研究中解析出的SARS-CoV-2-CTD/hACE2復合物晶體結構與這種低溫電鏡結構完全重疊，在722對Cα原子上的均方根偏差（root mean square deviation, rmsd）為1.019?。值得注意的是，最近也公開了三聚體SARS-CoV-2 S蛋白的兩個低溫電鏡結構，在這兩個結構中，它的受體結合區被埋入或暴露，這就與MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白的結構特征相一致。進一步的結構比對表明，在這種復合物中SARS-CoV-2-CTD的晶體結構也與這兩個低溫電鏡結構中的對應物非常吻合，與PDB代碼6VSB相關的均方根偏差為0.724?（暴露狀態）和0.742?（埋入狀態），與PDB代碼6VYB相關的均方根偏差為0.632?（暴露狀態）和0.622?（埋入狀態）。這些結果表明這種復合物的晶體結構與其各自的低溫電鏡結構一致，并提供了更詳細的結合信息。

　　考慮到SARS-CoV-2-CTD和SARS-RBD之間的高度序列一致性（sequence identity），在這兩種結合相同受體的病毒配體之間進行了原子比較。原子細節揭示了SARS-CoV-2-CTD/hACE2中存在比SARS-RBD/hACE2中更多的相互作用，包括更多參與這種相互作用的殘基，更多的范德華力接觸，更多的氫鍵以及更大的埋入表面積。有趣的是，β1'/β2'環是SARS-CoV-2-CTD和SARS-RBD之間變化最大的區域，而且相比于SARS-RBD β1'/β2'環，SARS-CoV-2-CTD β1'/β2'環賦予了SARS-CoV-2-CTD/hACE2更多的相互作用，包括強相互作用，比如芳香族氨基酸-芳香族氨基酸相互作用（aromatic-aromatic interaction）和離子相互作用。最近發表的一篇論文還表明，SARS-CoV-2 S蛋白以比SARS-CoV S蛋白更高的親和力與hACE2結合，這一點也在這項新的研究中得到證實。

　　S蛋白被蛋白水解成S1和S2是冠狀病毒感染的另一個先決條件。MERS-Uganda（即在烏干達蝙蝠中發現的一種MERS樣冠狀病毒）和蝙蝠冠狀病毒HKU4均可輕松與hCD26相互作用，但它們均需要被蛋白酶激活才能進入細胞。最近的一項研究表明與S1和S2亞基之間不包含弗林蛋白酶識別位點的SARS-CoV S不同的是，SARS-CoV-2 S蛋白包含一個潛在的弗林蛋白酶切割位點，可能被有效地加工成S1和S2亞基。據報道，絲氨酸蛋白酶TMPRSS2有助于促進SARS-CoV-2 S蛋白激活，而且一種被批準用于臨床的TMPRSS2抑制劑能夠阻斷進入細胞，并據此推測TMPRSS2抑制劑可能成為一種治療選擇。

　　盡管SARS-CoV和SARS-CoV-2在S蛋白上具有>70％的序列一致性，并且都通過CTD結合hACE2，但是在這項新的研究中，這些研究人員發現這兩種病毒的CTD在抗原性上是不同的。當使用一組靶向SARS-CoV S1/CTD的mAb時，沒有一種mAb能夠識別SARS-CoV-2 S蛋白。在這種測試中使用的mAb1和mAb2/mAb3已被確定分別與SARS-CoV S蛋白的330-350和380-399區域結合。但是，通過使用SARS-CoV S1亞基作為免疫原產生的其他三個mAb（B30A38，A50A1A1和C31A12）的結合位點仍然是未知的。與此相一致的是，最近發表的一篇論文也報道了相似的結果，即三個針對SARS-RBD的單克隆抗體S230、m396和80R無法結合SARS-CoV-2。此外，這項新的研究還證實針對SARS-RBD的多克隆抗血清不能識別SARS-CoV-2的S蛋白。對這兩種病毒配體的比較表明它們顯示出不同的靜電勢，這可能導致不同的免疫原性，盡管它們顯示出相似的蛋白折疊。

　　考慮到CTD在受體結合中的關鍵作用，這種受體結合實體代表了一種可用于疫苗開發的理想免疫原。比如，SARS-RBD和MERS-RBD蛋白均被發現可有效誘導中和抗體的產生。但是，鑒于觀察到SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的抗原性和靜電分布存在差異，因此尚不清楚先前開發的基于SARS-RBD的候選疫苗（比如亞基疫苗）是否會賦予有效的SARS-CoV -2預防。在這篇論文手稿的修改期間，其他研究也已報道了SARS-CoV S在小鼠和患者體內均誘發了多克隆抗體，從而有效地中和了SARS-CoV-2 S蛋白介導的細胞進入。值得注意的是，SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的S2區域具有較高的序列一致性（?90％），并且還包含中和表位。因此，針對S蛋白的SARS-CoV疫苗預防SARS-CoV-2的功效需要進一步評估和研究。

　　總之，冠狀病毒是人畜共患病原體，并通過跨物種傳播感染人類。SARS-CoV和MERS-CoV代表了冠狀病毒越過物種界限并導致人類感染的兩個臭名昭著的例子。先前的研究已表明，這兩種病毒在感染人類之前先從它們的天然宿主（蝙蝠）躍遷至中間適應性動物（對MERS-CoV而言為單峰駱駝）。描述這種跨物種傳播途徑可能對疾病控制很有指導意義。 盡管如此，SARS-CoV-2的天然宿主和中間適應性動物（如果有的話）仍然是未知的。這項新研究中顯示的SARS-CoV-2-CTD與hACE2之間的結構信息在未來應當可以通過表征S蛋白與不同物種的hACE2之間的相互作用來闡明這種病毒的跨物種傳播途徑。