Cystatin基因家族的生物信息學分析

實驗概要

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)基因廣泛存在于植物物種中。該類基因能夠起到抑制某些病原微生物和昆蟲體內半耽氨酸蛋白酶的作用，在植物的防衛體系中起到重要作用。我們利用已經分離出植物cystatin基因的cystatin結構域為檢索序列在基因組水平上對擬南芥和水稻中的cystatin基因家族的成員進行了鑒定和系統發生分析。

實驗步驟

1. 數據庫的搜索

植物中已經分離出的cystatin基因及其編碼的蛋白質序列來自于對NCBI數據庫的搜索。利用Pfam軟件預測這些基因所編碼的蛋白質序列的cystatin結構域。以所得到的這兩個cystatin結構域序列為搜索對象，在TIGR中公布的國際水稻基因組計劃的注釋數據庫(http://rice.tigr.org/tdb/e2k1 /osal /index. shtml)中搜索相似的蛋白序列，E值(expect value) ≤10^-10的序列被認為是候選蛋白。再利用Pfam軟件預測這些候選蛋白的cystatin結構域，若存在cystatin結構域，則認為該候選蛋白屬于cystatin蛋白家族，若Pfam未能檢測出cystatin結構域，則認為其不屬于該家族。利用水稻中獲得的cystatin結構域序列為檢索對象，在TIGR的擬南芥全基因組注釋數(http://www.ti}r.org/tdb/e2k1/athl/)中檢索擬南芥的cystatin候選蛋白序列，得到的候選序列同樣再次利用Pfam鑒定出其cystatin結構域序列。新檢出的cystatin基因繼續作為檢索序列，檢索以上數據庫，直至沒有新的序列檢出為止。獲得擬南芥和水稻的cystatin基因信息后，從TGIR數據庫中下載相應的核昔酸和氨基酸序列。

2. 序列分析

在得到擬南芥和水稻的cystatin蛋白家族的氨基酸序列后，利用ClustalX 1.83軟件對該蛋白家族的氨基酸序列進行多序列聯配，參數為默認。根據得到的多序列聯配的保守區段，使用Bioedit對聯配結果進行編輯。使用MEGA 4軟件中的Neighbor-Joining方法進行系統發生樹的構建，并利用Tree View 1.6.1軟件顯示系統發生樹。利用MEME(multiple EM for motif elicitation)軟件鑒定相關蛋白的基序(motif)，除發現基序的最多數目設置為50外，其余參數為默認。

3. 亞族間的功能性分歧分析

為評估該基因家族組間的功能性分歧，利用DIVERGE軟件計算亞族間的I型功能性分歧系數B和似然比測驗統計數。似然比測驗統計數近似服從于1個自由度的卡方分布，并以此來進行統計顯著性測驗。顯著高于0的B值表示在基因復制之后可變選擇壓力作用于一些氨基酸位點。

4. 適應性進化分析

本研究中利用兩種方法對擬南芥和水稻cystatin基因家族的適應性進化進行分析。首先利用Creevey-McInerney的方法確定系統進化樹中經歷適應性進化的分枝，該分析是通過CRANK程序進行的。其次利用Yang和Nielsen的方法對系統發生樹的每一分枝分別計算非同義替換率和同義替換率的比值(d_N/d_S)，d_N/d_S的計算通過兩個模型來實現，分別是單個比值模型(one-ratio model)和分枝模型(free-ratio for branches，并經過似然比測驗來確定適合的模型。

5. 基于EST的基因表達分析

擬南芥和水稻的EST數據來源于Genbank的EST數據庫。通過對擬南芥和水稻的cystatin基因的編碼序列(CDS)作為檢索序列，檢索NCBI的EST數據庫，取匹配率大于95、長度大于160bp并且E≤10^-10。的結果作為對應的EST序列，對相匹配的EST的結果按組織器官的來源進行分類，從而獲得擬南芥和水稻中的cystatin基因家族成員的表達信息。