DNA化學合成的應用

隨著DNA合成技術的發展，特別是自動化合成技術的引入，人們能簡便、快速、高效地合成其感興趣的DNA片段。目前，DNA合成技術已成為分子生物學研究必不可少的手段，并且已在基因工程、臨床診斷和治療、法醫學等各個領域中日益發揮重要的作用。

1. DNA合成在基因工程和分子生物學研究中的應用

1.1合成基因

目前有許多基因和蛋白質的核苷酸和氨基酸序列已得到闡明，人們已經可以根據需要合成出具有實際應用和研究價值的多肽和蛋白質基因。已報道的合成基因有人生長激素、干擾素、胰島素、表皮生長因子、白細胞介素II、集落刺激因子等，這些基因均已被克隆，絕大多數已在原核和真核系統中獲得表達。我國上海生物化學研究所等單位于19841年首次在世界上合成了具有生物學活性的酵母丙氨酸轉移核糖核酸，為人類文明作出了應用的貢獻。

目前，合成基因的方式有2種。①全基因合成：一般對于分子較小而又不易得到的基因采用該方式。可將雙鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基在在100個核苷酸以上時)，每個片段長度控制在40～60個堿基，并使每對相鄰互補的片段之間有～6個堿基交叉重疊。在體外將除基因兩端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA連接酶，即可得到較大的基因片段。如果需連接亞克隆的方法，最后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。采用分步連接、亞克隆的方法時，為便于亞克隆中回收基因片段。應在片段兩側設計合適的酶切位點，由于每個亞克隆可以分別鑒定，從而可減少順序錯誤的可能性。②酶促合成：此法又稱基因的半合成。全基因，特別是較大的基因的全部化學合成成本昂貴，使用半合成的方法可以降低成本，從而利于普及使用。首先合成末端之間有10～14個互補堿基的寡核苷酸片段，退火后以重疊區作為引物，在4種dNTP存在的條件下，通過DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反轉錄酶的作用，獲得兩條完整的互補雙鏈。在合成基因的結構中，應包括有克隆和表達所需要的全部信號及DNA順序，基因密碼的閱讀框架也應該同表達體系相適應。此外，由于不同種類的生物體或密碼子的使用都具有明顯的選擇性，在基因合成和克隆時必須考慮這個問題。選擇合適的密碼子，以獲得高效表達。

1.2 合成探針

基因的克隆和分離已成為現代分子生物這研究必不可少的手段。DNA合成技術在其中起著越來越重要的作用。它不僅使得過去頗費周折的基因篩選與鑒定成為常規技術，而且使得克隆載體的構建及克隆基因和載體的連接變得更加容易和準確。蛋白質的結構可以通過mRNA的結構間接地得出。相反，如果已知某個肽段的氨基酸順序，也可根據密碼簡并的原則推導出所有可能的mRNA序列密碼。人工合成的具有特定順序的寡聚DNA片段，已應用于篩選和鑒定重組質粒或λ噬菌體。實驗證明用合成的寡核苷酸片段，即使只有1對堿基錯配采用嚴謹條件雜交也能與完全互補的雙鏈相區別。因此，使用作探針的寡核苷酸，應將密碼的簡并度調至最高限度時，可減少假陽性，增加篩選的準確率。

1.3 合成引物

1. 合成PCR引物進行基因擴增：PCR技術是80年代中期發展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術。該法操作簡便，可在短時間內在試管中獲得數百萬特異DNA序列拷貝。PCR技術的特異性取決于所用引物和模板DNA結合的特異性。合成引物在PCR反應中的使用。
   

2.序列測定用引物：DNA序列測定是分子生物學中最重要和最精細的研究技術，其中最常使用的是末端終止法，即是一種依賴于特異DNA引物的序列測定方法，此外該法對模板的需要量較大，這就要求待測DNA片段尤其是拷貝數少的片段首先克隆到適合的載體中經過擴增后進行序列測定。常用的克隆載體如M13、pUC19、PBR322等均可購到有商品出售的公用測序引物。

3.合成導入突變用的引物：利用寡核苷酸引導的突變，可在目的DNA序列的任何部分產生點突變、插入和缺失，從而使得基因編碼的蛋白質在結構和功能上發生改變。

1.4 合成連接子和接頭

在DNA重組中常需要將外源DNA片段插入某些載體DNA中。如果載體或外源DNA上沒有合適的限制性內切酶位點，為提高插入效率或實現定向克隆，可采用合成連接子(linker)和接頭(adaptor)的方法。使用連接子和接頭需要插入片段是平末端，否則，首先需要用DNA聚合酶I大片段補齊或者用核酸酶S1或Bal₃₁處理得到平末端后才可同連接子或接頭連接。

具有多酶切點的接頭(polylinker)還廣泛應用于構建某些運載體，使之帶有多個新的酶切位點。這在質粒pUC系列及用于序列分析的M₁₃mp噬菌體系統中都得到了廣泛的應用。接頭片段帶用來調整表達載體的讀碼框架，用于基因表達及功能的研究。

２合成基因在醫學中的應用

隨著科學技術的發展，人們對疾病的認識已逐步從整體和器官的水平深入到細胞分子水平。醫學家發現，許多嚴重危害人類健康的疾病，如遺傳性疾病、腫瘤、心血管疾病等可在基因結構上找到某些變化，如基因的缺失、突變、轉位或致病左因的存在，以此作為證據亦可對這些疾病作同相應的判斷。例如鐮刀狀細胞貧血癥即是由于A→T突變造成β-珠蛋白第六位谷氨酸變為纈氨酸，從而造成珠蛋白結構異常，并引起紅細胞形態及對氧的親合力發生改變。通過人工合成的19個核苷酸作為探針即可明確區別正常人、雜合和純合的病人。目前，合成DNA探針已廣應用于臨床，成為一種有效的診斷手段。

２.1 用于遺傳病的診斷

過去僅有少數遺傳性疾病可以憑借蛋白質和酶學方面的異常作出判斷，隨著分子生物這的發展，對遺傳病的診斷有了巨大的進步，出現了基因診斷法。醫學上使用基因診斷法最早成功的報道是1985年Saiki等人對鐮刀狀紅細胞貧血的診斷。另外，對于以突變為主的β-地中海貧血，以合成DNA片段為探針，亦可得同滿意的結果。

２.2 用于傳染病的診斷

臨床上對傳染性疾病的傳統診斷程序常常是檢濁病原體及其抗體，需時較長，達不到早期診斷的目的。合成探針在傳染病特別是由病毒感染性所致的傳染病檢測中，已得到廣泛應用，尤其是結合PCR方法使診斷的靈敏度可進一步提高，目前國內已制出檢測乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、輪狀病毒和皰疹疾病等多種基因探針診斷試劑盒。

人工合成核酸在醫學上不僅可以作為一種手段，而且在某些疾病的治療上顯露了端倪寡聚核苷酸及其衍生物對腫瘤的治療已經取得可喜的進展。作為蛋白質翻譯抑制劑的寡核苷酸現稱為反義RNA或反義DNA。其作用原理可能有以下幾種：①反義RNA與體內靶mRNA結合形成雙螺旋，使mRNA不能成為翻譯蛋白質的模板。②反義RNA(DNA)與DNA結合。影響DNA復制。③反義RNA能阻止mRNA與核蛋白體結合，降低蛋白質合成效率。

反義RNA或反義DNA最近年來國際上研究課題的熱點，人們寄希望它在抗病毒，尤其是對艾滋病和腫瘤基因治療上發揮重要，為征服這兩類嚴重威脅人類健康的疾病作出貢獻。