DNA單鏈斷裂檢測技術：單細胞凝膠電泳（SCGE）檢測原理..

DNA單鏈斷裂檢測技術：單細胞凝膠電泳（SCGE）檢測原理和操作步

放回玻片托盤中待瓊脂糖凝固。
（3）裂解：
移開蓋玻片，將載玻片緩慢浸入新配制的冰涼的細胞裂解液中，置于4℃冷藏至少1h。細胞可在裂解液中至少保存4周，但時間太長可能會引起緩沖液沉淀。
堿性細胞裂解液配制（每1000ml）方法：
a、2.5mol/L NaCl 146.1g；
b、100mmol/L EDTA 37.2g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用約12g NaOH 調至pH值為10；
e、1%肌氨酸鈉10g；
f、用去離子水定容至890ml，過濾除菌，為儲備液，室溫保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO為應用液，在應用前冷藏30-60min。
中性細胞裂解液配制方法：
a、2mol/L NaCl 117g；
b、30mmol/L EDTA 12.4g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用約12g HCl 調至pH值為8.2-8.5；
e、1%肌氨酸鈉10g；
f、用去離子水定容至890ml，過濾除菌，為儲備液，室溫保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO為應用液，在應用前冷藏30-60min。
（4）電泳：
將冷藏1h后的載玻片從細胞消化液中輕輕取出，并列置于水平凝膠電泳槽中陽極端附近，載玻片間不留空隙。
向電泳槽中加入新配制的電泳緩沖液應用液，使液面完全覆蓋載玻片。應防止在瓊脂糖上產生氣泡。
將載玻片在堿性緩沖液中放置20-60min，讓DNA在電泳前解螺旋和產生堿性易損性損傷。時間越長，損傷表現得越充分。
在室溫下，置電壓25V，調整電泳槽中緩沖液液面高度使電流為300mA，根據研究目的會對照樣品的遷移情況，電泳10-40min。不同類型的細胞電泳時間不同。
堿性電泳液應用液（1000ml）：
a、300mmol/L NaOH 12g；
b、1mmol、L EDTA 372.24g
c、稱取上述試劑后，用1000ml去離子水融解（pH>13）備用，注意在臨用前現配。
中性電泳緩沖液應用液（0.5%TBE）：
a、2mmol/L EDTA；
b、90mmol/L Tris；
c、90mmol/L 硼酸；
d、調pH 8.2-8.5，注意在臨用前現配。
（5）中和：
切斷電源，將載玻片置染缸，用中和緩沖液浸洗，每次5min。晾干，重復2次。目的是防止堿液和去污劑干擾溴化乙錠染色。
中和緩沖液（0.4mol/L Tris）:
a、Tris 48.5g；
b、加去離子水定容至1000ml；
c、用>10mol/L HCl調pH值至7.5，室溫儲存。
（6）溴化乙錠染色：
呈中性后，晾干載玻片，將玻片用0.5ulEB應用液染色，蓋上新蓋玻片。
溴化乙錠（EB）染液（10 x儲備液，即20ug/ml）；
a、溴化乙錠 1mg；
b、去離子水 50ml；
c、室溫貯存，臨用時見儲備液稀釋10倍。
EB為誘變劑，小心操作。
注意：以上（1）-（3）步應在黃色、紅色燈光下或暗處進行，以免額外DNA損傷，載玻片可在潮濕環境中保存72h，但最好在24h內讀片。
（7）鏡檢姐結果評價：
EB染色后的DNA樣品應盡快在熒光顯微鏡下觀察。未受損細胞表現為一圓形熒光核心，即彗星頭部，沒有尾巴。而受損細胞則有彗星尾從核中伸向陽極，形成一個亮的熒光頭部和尾部。用目鏡測微尺測定或拍攝X 400黑白顯微照片再作測定。每隔樣品中至少隨機挑選25個細胞測定。測定受試組合對照組核DNA直徑和DNA遷移長度，再用透明尺測量彗星遷移部分的面積。也可測其斜度和峭度，因不受試物引起的彗星形狀可有差異。
統計時，比較受試組和對照組之間的彗星尾長，或計算受試組（T）與對照組（C）彗星尾長之差（T-C）即T-C<10um（一）；10-20um（±）；20-40um（±）；>40um(++).另外，也可計算各族受損細胞率，即彗星尾長<35um為未損傷；35-70um為中度損傷；>70um為重度損傷，此值在不同細胞稍有差異。