DNA復制時序對表觀遺傳信息及染色質高維結構的影響

　　Science |

　　在細胞周期的S期，基因組DNA按照時間先后順序發生復制，DNA復制的時序被稱為replication timing（RT）。RT是真核生物基因組的保守特征，與組蛋白翻譯后修飾及染色質高維區室結構等表觀遺傳特征高度相關。RT是否能在細胞周期中維持染色質的某些結構及表觀遺傳特征尚不明確，回答以上問題需要在全基因組范圍對RT進行干擾。此前已有研究發現敲降真核生物中保守的復制相關蛋白RIF1可以影響局部區域的RT。但RT的完全刪除對表觀遺傳信息及染色質高維結構的影響尚未見報道。

　　2021年4月23日，來自美國Florida State University及Emory University等的多個研究團隊合作，在Science上發表了標題為Replication timing maintains the global epigenetic state in human cells的研究論文，首次利用RIF1的敲除來研究RT的刪除對細胞周期中染色質性狀維持的影響。

　　作者首先在RIF1敲除的H9人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs），HCT116及HAP1細胞系中分別獲得了高分辨率的Repli-seq圖譜，以觀察RIF1敲除在不同細胞類型中對全基因組范圍的RT的影響。相較于其他兩個細胞系，RIF1敲除的hESCs表現出最嚴重的RT紊亂，即早（E）和晚（L）的復制區混為一體，表明復制的時序性完全被打破。與之前報道的RIF1敲除細胞呈現的早晚復制區的交換現象不同的是，HCT116中敲除RIF1對早復制區的影響更大，而晚復制區基本不受影響。進一步研究發現，RT受影響的區域都富集RIF1，而RT不受影響的區域都缺少RIF1但富集抑制性組蛋白修飾H3K9me3的寬廣區域（large domains），RIF1的敲除對這些區域的H3K9me3基本沒有影響，而H3K9me3的敲降會讓這些區域提前復制。

　　由于晚復制區通常處于轉錄抑制性的B區室，作者進一步采用Hi-C捕捉了全基因組的區室結構，發現RT不受干擾的晚復制區在WT中存在更強的遠程相互作用，RIF1敲除后H3K9me3上調的程度和晚復制區相互間區室作用上調的程度成正比，暗示H3K9me3富集的晚復制區依賴區室而不是RIF1來維持其RT。相反，早復制區域相互間的區室化在RIF1敲除后變弱，其中的H3K27ac及H3K4me3的信號也變弱。以上發現表明RIF1敲除不僅會改變表觀遺傳信息，還會改變染色質高維結構。為進一步證明RIF1對以上因素的影響依賴DNA復制，作者采用細胞周期同步化手段將WT和RIF1敲降的細胞同步化到G1期，再將其釋放到早、中、晚S期，通過Hi-C及ChIP-Seq比較染色質區室結構及組蛋白修飾在復制前后的變化。結果表明，RIF1敲降對染色質遠程互作強度及H3K27ac、H3K9me3等表觀遺傳修飾的干擾均發生于S期。WT細胞中，早復制區及A區室相互間的染色質遠程互作在S期早期上升隨后下降，而敲降RIF1后以上遠程互作在S期早期的上升趨勢變弱，在S期中后期延遲下降。相反，晚復制區及B區室相互間的染色質遠程互作在S期前期迅速下降并在S期的中后期小幅度恢復，而在敲降RIF1后以上遠程互作在S期早期下降趨勢變弱，在S期中后期上升趨勢不夠。以上變化都證實了RIF1對不同染色質區室結構的影響發生于DNA復制的不同階段。類似的，RIF1敲降后活性增強子及啟動子相關的H3K27ac修飾的丟失發生于S期的中后期，而轉錄抑制相關的H3K9me3修飾的丟失發生于S期的后期，表明RIF1對表觀遺傳修飾的影響也依賴DNA復制的過程。

　　為明確RIF1全敲引起的RT改變是一輪細胞周期的產物還是多輪細胞周期累積產生的效果，作者采用了AID可誘導降解RIF1的方式，檢測RIF1降解24、48及96小時后（分別相當于1、2及4個細胞周期）RT、表觀遺傳修飾及染色質遠程互作的變化特征。盡管RT在RIF1降解24小時即第一輪細胞周期時就達到RIF1全敲的效果，但是H3K27ac及H3K9me3等組蛋白修飾在RIF1降解96小時后仍未完全復制RIF1全敲的表型，且不受RIF1干擾的晚復制區相互間的遠程互作在RIF1降解96小時后也未及RIF1全敲的效果。以上結果均表明RIF1全敲后RT紊亂導致的表觀遺傳修飾及染色質組裝的錯誤是多輪細胞周期累積的產物。

　　Florida State University的David M. Gilbert教授是本文的通訊作者，博士研究生Kyle N. Klein、Peiyao A. Zhao及Emory University的博士后呂曉雯（Xiaowen Lyu，現任職廈門大學醫學院）為本文的共同第一作者，Emory University的Victor Corces教授及University of Georgia的Stephen Dalton是本文的主要作者。