DNA復制檢驗點通路成員協同響應DNA復制脅迫的分子機制

中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院甘海云課題組在PNAS上，發表了題為《復制脅迫狀態下芽殖酵母中Rad53耦聯先導鏈和后隨鏈DNA合成的機制》（A mechanism for Rad53 to couple leading- and lagging-strand DNA synthesis under replication stress in budding yeast）的論文，揭示了DNA復制檢驗點通路成員協同響應DNA復制脅迫的分子機制。

　　細胞分裂前的物質準備過程中，需要完成對遺傳物質的復制。以有絲分裂為例，遺傳物質DNA的復制主要發生在分裂前的S期。DNA能否及時準確的復制，既關系到細胞能否完成分裂，又關系到遺傳信息能否被準確地傳遞給子代細胞。然而，DNA復制過程中會遇到影響復制的因素，如DNA損傷、雙脫氧核糖核苷酸（dNTP）水平降低、轉錄與復制機器遭遇等。此類現象稱DNA復制脅迫（replication stress）。

　　為了應對復制脅迫，生物體進化出檢驗點（checkpoint）機制（圖1）：DNA復制脅迫發生時會產生單鏈DNA，感應器蛋白感受到單鏈DNA的存在后，會激活激酶Mec1（哺乳動物中的同源蛋白為ATR），Mec1被激活后通過磷酸化下游蛋白的形式將信號逐級轉導至效應激酶Rad53（哺乳動物中的同源蛋白為Chk1），激活后的Rad53會對DNA復制過程進行多重調控以應對復制脅迫。盡管Rad53作為響應DNA復制脅迫的檢驗點早已明確，但這一過程中Rad53如何協調復制機器中較多蛋白的具體分子機制尚不清楚。

　　2014年以來，甘海云致力于DNA復制機器響應DNA復制脅迫的機制研究，與合作者開發了eSPAN技術（Molecular Cell，2014），該技術使特異檢測DNA復制過程中前導鏈和后隨鏈結合蛋白成為可能。eSPAN（enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA）技術巧妙地將BrdU（脫氧核糖核苷類似物，溴脫氧核苷尿嘧啶）標記的新生DNA鏈富集技術與染色質免疫共沉淀（ChIP）技術結合，并利用新生前導鏈與新生后隨鏈方向不同的特征來探究蛋白在前導鏈和后隨鏈上的結合情況（圖2）。

　　科研人員利用該技術對比分析了DNA正常復制與DNA復制脅迫狀態下前導鏈與后隨鏈結合蛋白的異同。結合對比分析結果和相關遺傳學研究結果發現，當降低胞內dNTP水平使DNA復制處于脅迫狀態時，位于滯后鏈的上的PCNA會在檢驗點激酶Mec1和Rad53的調控下，從滯后鏈上脫離以維持復制脅迫狀態下的基因組穩定。研究進一步運用該技術對比分析了檢驗點激酶Rad53缺失與否狀態下的復制叉及其結合蛋白的狀態。當檢驗點功能缺失且復制脅迫存在時，DNA復制解旋酶CMG復合體仍會前進并解開雙鏈DNA，但前導鏈復制較滯后鏈慢，導致前導鏈暴露出大段單鏈區域（后續表述稱不對稱復制）（圖3）。這表明檢驗點激酶Rad53能夠協調DNA解旋酶復合體與前導鏈和后隨鏈復制速度，從而防止大段單鏈DNA暴露引起的復制叉坍縮及DNA損傷（Molecular Cell，2017）。

　　上述研究初步揭示了檢驗點激酶Rad53在受到復制脅迫時對復制體蛋白的調控機制。而由于Rad53在復制檢驗點通路中處于下游位置，整個復制檢驗點通路是否參與該調控過程尚不清楚。

　　本研究中，甘海云團隊闡釋了DNA復制檢驗點通路成員對脅迫狀態下復制叉狀態的影響，發現了檢驗點通路成員Mec1，Mrc1（哺乳動物中的同源蛋白為Claspin）突變后與Rad53突變體的表型高度一致（不對稱復制），表明DNA復制檢驗點通路是通過Rad53對復制體蛋白進行調控。

　　此外，Mrc1具有檢驗點功能，并直接參與DNA復制。Mrc1檢驗點功能缺失時，細胞響應復制脅迫的表型與Rad53突變體和Mec1突變體一致，而刪除Mrc1的復制功能時，不對稱復制的表型消失。這暗示Mrc1的復制功能可能是檢驗點Rad53的調控靶點。根據這一假設，進一步的遺傳學實驗發現在Rad53突變體中刪除Mrc1會使Rad53突變體的不對稱分裂表型消失，這一結果初步證實了上述推測。

　　Mrc1是通過與Tof1-Csm3形成復合體來行使其DNA復制功能。那么，Tof1是否也參與這一過程？研究進一步剖析了Tof1突變體表型，證實了Tof1處在這一調控通路中。至此，該研究解析了檢驗點蛋白是如何在復制脅迫的情況下調節DNA復制的分子機制——細胞感受到復制脅迫后，激活了復制檢驗點通路Mec1 à Mrc1 à Rad53，激活后的Rad53則通過調節Mrc1-Tof1來實現對前導鏈和后隨鏈的復制協調以防止出現單鏈DNA造成基因組不穩定（圖4）。

　　研究工作得到國家自然科學基金重大項目、廣東省合成基因組學重點實驗室以及深圳合成生物學創新研究院的支持。美國哥倫比亞大學科研人員參與該研究。