DNA定點突變實驗

定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。

DNA

pyrobest DNA聚合酶 DpnI 去離子水 BSA 大腸桿菌DH5a菌株

PCR儀 離心管 移液槍 槍頭 槍頭盒 水浴鍋 滅菌鍋 培養箱

一、引物設計

每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45 bp，設計的突變位點需位于引物中部。

二、反應

1.  使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循環次數少，一般為12個循環。

2.  反應體系：

（1）10x pyrobest Buffer： 5 ul

（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul

（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul

（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul

（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul

（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul

（7）加無菌蒸餾水至50ul.

三、產物沉淀純化

1.  加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20℃冰箱）5min，離心棄上清。

2.  70~75%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。
 

四、DpnI酶切

1.  酶切體系

（1）Buffer ：2 ul

（2）BSA（100x）：0.2 ul

（3）DNA ：x ul

（4）DpnI：0.5 ul

（5）加無菌去離子水至 20 ul。

2.  30℃酶切 1~4 h。

3.  65℃水浴15min 終止反應。

五、轉化

將酶切產物轉化大腸桿菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。

六、測序驗證

1.  引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。

2.  Quick change試劑盒分為幾種不同的類型，QuikChange?、Site-Directed Mutagenesis Kit標準點突變試劑盒 、QuikChange?、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit長模板單點突變試劑盒（>8kb）從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長片段擴增的酶和BUFFER罷了，沒什么特別的東西。

3.  DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。

4.  實驗板長出來的菌有兩種可能，一種是質粒DPNI沒處理干凈長出來的（模板），一種是PCR產物轉化出來的（突變體），不過這兩種菌長得一模一樣，即使提出質粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區分），除了測序，是分不出來的。

5.  做PCR時也最好做一個負對照（不加引物），實驗管由于PCR時有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產物，而對照管由于PCR時沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。如果兩者都拿去DNPI處理，就能夠證明模板已經被去除干凈。若實驗順利的話應該是：正對照長菌負對照不長菌。如果出現正負對照都長菌，那么就是DpnI沒處理好，如果正負對照都不長菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說PCR出問題了，另外一個可能就是轉化出問題了。要搞清楚是哪個問題，跑膠說明不了問題，那就做個轉化的對照，拿試劑盒的對照實驗去試感受態，馬上就能知道轉化有沒問題。

一、經驗分享

1.  實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：

第一：我們吊出來的基因有點突變，相信這可能是大家經常會遇到的問題。基因好不容易吊出來，并裝進了自己的載體，卻發現有一兩個堿基跟自己的預期序列或所有的公共數據庫不匹配，然后暴昏。

大家實驗室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應該用得不多吧，Taq酶的優點和缺點都很明顯：優點就是擴增效能強，缺點就是保真性差，其錯配機率是比較高的，相關數字忘了，大家可以去網上查那個數字，不過感覺如果是2000bp的基因，如果擴四五十個循環的話，很大機率會出現點突變，當然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關系，詳細情況這里就不討論了。

第二：要研究基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實驗需要，相信這也是那些研究基因的人經常的一種思路吧。

對于第一種情況：我們首先要分析出現堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如說是三聯密碼子的最后一位，堿基的改變并沒有引起相應氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化，也就是說同一個基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個相匹配，一般也就可以不做定點突變了。如果有時間沒錢，那干脆重新PCR然后再克隆進自己的載體了，不過最好換個保真性好一點的酶如PFU，或者PCR循環數低一點，不過這些東西有時候也得靠運氣啦。實在不行的話再來做定點突變。

對于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點突變了。

接下來開始聊一聊定點突變的原理吧，那個Stratagene試劑盒！上面有一個說明書，說得好像很正規，不過上面好多都是什么ZL啊什么注意之類的話，看都不看，我們簡明扼要地只講實驗方面，通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。

2.  大家馬上就會想到幾個問題了：

第一：引物怎么設計呢？

第二：模板怎么去掉呢？

第三：怎么拿到質粒呢？

對于第一個問題：怎么設計引物？

我只能講一些原則，并舉一些例子。

引物設計的原則其它貼子上都有講，這里就不重復了：

不過這種突變引物要加上一個原則：

一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12base pair。

若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，大家應該都知道，引物至少要11-12個base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個base pair，并且合成多一條反向互補的引物。

這么說大家可能不是很清楚，那我就舉個例子吧：

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960

現有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924

*********************************************** ************

|------>deletion

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020

現有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984

************************************************************

（上面為目的序列，下面為現有序列：我們發現有一個A堿基的缺失，其直接結果是在表達蛋白時后面的氨基酸全部錯配）

我們以它為中心設計引物：兩邊各至少12個堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低，故拉長引物使GC%含量不至過低，也使引物退火溫度升高。

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG

并合成反向互補引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

其實也不一定要反向互補序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個堿基，同時符合引物設計的原則就行了。

引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價錢質量上有一些差別，不過價錢一般都是一塊多一個堿基，合成時間約為一周。

這樣的結果是PCR時把整個質粒都給擴出來了，得到的PCR產物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產物

對于第二個問題：

怎么去掉模板呢？再簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不會影響PCR產物，從而去掉模板留下PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會那么湊巧吧，哈哈。

關于第三個問題：

直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了，呵呵，然后再篩選出陽性克隆，并提出質粒，拿去測序（這個就不用我多說了吧），驗證突變結果，一般都沒問題的啦，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的，呵呵，不要砸我啊。

下面講一下具體的實驗步驟以及一些實驗中要注意的事情：

1、 根據現有基因設計引物；

2、 合成引物并準備好模板；

3、 PCR，

4、 DpnI處理酶切產物；

5、 轉化酶切產物；

6、 篩選 陽性克隆；

7、 送測序并測全長。