DNA序列分析技術1

物種的遺傳多樣性在本質上是DNA 一級序列的多樣性。近年來，隨著DNA 測序技術的迅速發展和日益普及，DNA 測序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來越大的作用。本章將介紹目前在遺傳多樣性研究中常用的一種手動和一種全自動雙鏈DNA 測序方法。

1.DNA 模板的制備
在遺傳多樣性的研究中，由于樣本量一般都較龐大，因而DNA 測序的速度就成了很關鍵的因素。因此，這類研究中常常直接測定純化的PCR 雙鏈產物而不大采用克隆技術。本節介紹本實驗室常用的從PCR 產物制備測序模板的方法，即低熔點膠回收法。
（1）制備1.5％～2.0％的瓊脂糖凝膠，待其充分凝固后，在離點樣線5cm 左右處切下寬約1cm 的膠條，在切出的槽中倒入預先煮沸的低熔點瓊脂糖膠。

（2）低熔點膠凝固后，將待純化的PCR 反應液全部點樣，恒壓100V 左右進行電泳，直至擴增片段進入到低熔點膠中部。在360nm 紫外光下，將已進入低熔點膠的條帶切下，放入1．5ml 離心管中。
（3）離心，將膠塊壓縮到管底，然后補加 TE 至 500μl。于 68℃水浴，將低熔點膠熔化，再迅速加入等體積的水飽和酚并混勻。
（4）室溫下振蕩抽提10 分鐘，再12 000r／min 離心 10 分鐘。取上清液再用氯仿-異戊醇（24:1）抽提5 分鐘。
（5）12 000r／min 離心 10 分鐘，取上清液，在其中加入 1／10 體積的 10 mol／dm3NH4Ac 和2 倍體積的無水乙醇，置—70℃下沉淀半小時以上。

（6）再12 000r／min 離心 10 分鐘，沉淀用 70％的冷乙醇洗滌；再次短暫離心后小心地倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入20～50μlTE 緩沖液或無菌去離子水中溶解，即為制好的DNA 模板。
目前還有一些非常有效的商售試劑盒可用于純化 PCR 產物，如 Oiagen PCR 產物純化試劑盒等，但成本較高。

2.手動DNA 序列分析技術

1) 測序膠的制備
按以下配方制備測序電泳膠：
6％膠工作液 70ml
10％過硫酸胺（APS） 70μl（新鮮配制）
TEMED 70μl
將上述溶液混合后，灌入準備好的膠板中，將“鯊魚齒”梳子反插入膠，深約0.5～1.0cm。
室溫下聚合1 小時左右。

2).測序反應
測序試劑盒購自美國 USB 公司，測序酶為 Sequenase Version 2.0；α35S-dATP 購自美國DuPont 公司（1mCui／100μl）。測序反應按USB 推薦的方法進行：
（1）DNA 模板混合液（0．5ml Eppendorf 管）：
DNA 模板 7μl
測序引物 1μl
5 倍 Reaction buffer 2μl
NP4O 1μl
（2）標記混合液（每一反應的量）：
DTT（0.1mol／dm3） 1μl
1／5dGTP labelling mix 2μl
Enzyme dilution buffer 1.75μl
NP4O 0.55μl
去離子水 0.375μl
測序酶 0.125μl
35S-dATP 0.5μl
（3）ddNTP（ddA、ddG、ddC、ddT） 2.5μl
（4）退火反應（annealing）：將DNA 模板混合液煮沸3 分鐘，迅速放入乙醇和干冰的混合冰浴箱中退火30 秒左右（如無干冰，則用冷凍于－20℃～－70℃下的無水乙醇，臨用前由冰箱中取出）。在進行標記反應之前，反應液需保存于干冰或碎冰中。
（5）標記反應（labelling）：由干冰或冰中取出經退火的DNA 模板混合液，放在手中使其融化，然后加入 5.5μl 的標記混合液。在微型離心機上離心 10～15 秒后，置室溫中 1 分鐘。
（6）鏈終止反應（termination）：將上一步驟制成的混合液以每管3.3μl 分裝入預先在37℃下溫浴的加有ddNTP 的管中，并在37℃下反應4～5 分鐘。
（7）每管加入4μl 終止液（stop solution）。