DNA快速檢驗全球研究進展（三）

芯片毛細管電泳具有進樣量少，靈敏度高，分析速度快等特點，非常適合法醫DNA-STR的快速檢驗。毛細管電泳芯片由于尺寸小，可施加較大場強，所以在幾秒鐘內就可完成對樣品的分離，微陣列毛細管電泳芯片可實現高通量檢測則成為目前學者研究的熱點。2002年Emrich CA等[31]報道的將高通量384孔毛細管陣列微電泳芯片集成在半徑僅為8 cm的圓盤上，7 min內實現了同時對384份樣品的檢測；2006年Yeung等[32]制作的高通量96孔毛細管陣列微電泳芯片可在30 min內同時實現96個樣本檢驗，這些均進一步顯示了微芯片技術在DNA-STR快速分析方面的巨大潛力和優勢。為了防止樣品間發生交叉污染，降低成本，可以構建一次性的塑料材質的微整列電泳平臺。

集成式芯片是當前微流控芯片研究的核心，如Hagan等[29]將DNA提取和RCR擴增集于一塊芯片上，通過采用固相提取，使用快速啟動DNA聚合酶及紅外加熱方式，在45 min內完成了口腔拭子的提取和PCR擴增；Roux等[33]將芯片PCR擴增和電泳檢測集成在一次性的塑料芯片上，通過非接觸式紅外加熱方法僅在7 cm芯片上完成了電泳分離；季旭等[34]研制的一種集成PCR反應室與毛細管電泳CE的生物芯片，將硅片上制造的通過電阻加熱的凹槽作為擴增池，在擴增池下游設計制造毛細管電泳系統，并通過紫外光等檢測器判斷結果，從而實現了樣品擴增、電泳分離和紫外光檢測的單片集成。Liu等[35]將特定DNA模板的純化、PCR擴增、進樣以及電泳全集成于一張微流控芯片上，并可在3 h內實現對樣本DNA的檢驗（如圖 3所示），該全集成芯片原理結構為兩個完全相同的分析系統在4 in（1 in=2.54 cm）玻璃晶片上形成對稱的雙峰，每個分析系統包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）微泵和兩個PDMS微型閥用于流體控制，首先通過4 cm長的珠捕獲結構用于DNA分叉通道系統模板的捕獲。圖 3（b）為加熱器和電阻溫度檢測器（RTD），用于控制250 nL PCR室的擴增。圖 3（c）為500 mm長的雙T通道錐形結構，用于控制PCR的純化和進樣，24 cm和14 cm長的通道用于CE分離，同時這兩個系統共享陽極、陰極，進一步節省了芯片的使用空間。文獻[36]在2014年將全集成芯片技術成功應用于對模擬犯罪現場樣本檢材的檢驗。全過程包括制備特殊酶的反應液用于DNA的提取，采用紅外非接觸式控溫技術完成PCR擴增和高分辨的電泳分離方法在2 h內完成了對樣本的準確分型，并與傳統方法分型結構一致。

4.2 芯片化法醫DNA檢測的實現方式

4.2.1 微流控芯片DNA提取條件的優化

對提取進液量進行篩選，包括提取過程中的水，NaOH，HCL以及最后沖洗的水和TE緩沖液的體積，通過控制變量法，分別設置不同的體積梯度和停留時間，進行自動化提取，按照正常的擴增體系，并同時設置陽性對照和空白對照進行比較確定出最佳進液量；對于提取進液的管道可以設置多種不同的長度并運行自動化提取流程，提取后取出芯片上的載體物質進行常規的PCR擴增并檢測，通過比較不同長度管道的擴增效果確定出最佳管道長度。

4.2.2 微流控芯片PCR擴增與優化

對芯片PCR材料進行生物相容性驗證是芯片PCR正常擴增的前提，因為一般芯片的結構是兩種以上的材料通過鍵和組成，在此過程中可能會有抑制物釋放出來從而影響后續的PCR擴增。直接將芯片的原材料剪取小塊，放入擴增體系，加陽性標準品，擴增檢測，同時設立不添加原材料的陽性對照，3個重復；分別用高溫浸泡的芯片材料和去離子水配置PCR反應體系進行擴增檢測，同時設置正常去離子水為陽性對照，3個重復；用去離子水沖洗鍵合芯片材料3次，配置PCR反應體系進行擴增檢測，同時設置正常去離子水為陽性對照，3個重復；對提取裝置最后的沖洗水進行研究，配置PCR反應體系進行擴增檢測，同時設置正常去離子水為陽性對照，3個重復，對以上結果進行比較，如果熒光信號基本無差異則相容性良好。

微流控芯片PCR的實現重點在于對芯片材料屬性的研究和芯片擴增體系的優化兩部分。首先了解芯片的基本結構，一般芯片腔室的實際溫度和PCR擴增儀顯示的溫度有較大差別，所以需進行芯片溫度校準，以保證規定時間內有足夠的退火溫度和延伸時間；由于芯片材料的不同，即使對芯片PCR沒有抑制作用，但是由于芯片比表面系數的增加，對蛋白酶的吸附逐漸增加，以及載體的存在，吸附會更明顯，所以通常對芯片進行預處理，使內壁和反應體系隔絕，可以采用一定濃度的BSA、PEG進行芯片涂布預處理。微流控芯片對PCR某些成分的吸附，會影響PCR的擴增效果，通過對擴增體系中不同反應液的分析和濃度調節，盡量改善擴增效果。采用控制變量法，分別對不同成分設置濃度梯度，進行擴增檢測，并且同時設立常規檢測進行比較；操作者可在擴增體系中加入不同濃度梯度的BSA、PEG，并設立常規陽性對照，3個重復進行比較，從而確定出最佳擴增體系。

4.2.3 毛細管芯片電泳系統的優化

根據毛細管電泳技術的基本原理，影響電泳的因素主要有電場強度、毛細管的材料和內壁、緩沖液的成分、溶液的pH值和濃度、溫度等。對于電泳篩分介質的制備，參考已有成果制作篩分介質并同時選擇3種商品化的篩分介質進行比較；對于管道表面修飾，參考已有研究成果進行動態涂布、靜態涂布處理，填充自制的篩分介質后備用。芯片毛細管電泳實驗采用懸浮式的進樣方式，參考已報道的研究成果，選取合適的電壓、時間、光信號進行電泳檢測。

5 全自動DNA分型檢測設備

近幾年，國外相繼有3種全自動DNA分型檢測設備上市（見表 2）。2013年美國IntegenX公司全球首家推出RapidHIT200 DNA快速檢測儀，針對唾液、血液、血斑、唾液斑等樣品，通過選用Promega PowerPlex 16HS試劑，分型成功率均在89%以上，并且可在現場90 min內快速完成DNA檢測[37-38]，并且輸出的結果可與CODIS及中國DNA數據庫比對。2016年最新升級的RapidHIT200 DNA快速檢測儀與GlobalFiler Express試劑相結合，可同時檢測7個樣本。文獻[39]用150份口腔樣本進行驗證，進一步說明了檢測準確率更高，設備靈敏度高（從6 260個細胞中獲得37.5 ng DNA）。DNAScanTM快速檢測設備是美國多政府部門合作在法律部門，刑事實驗和生物測定實驗室推行快速DNA檢測技術項目（Acceleted Nuclear Equipment，ANDE）研究成果之一。該快速設備使用一體化BioChipset試劑盒，在85 min內同時完成5個單一來源樣本的DNA檢測，符合美軍用810F耐用標準，并且通過沖擊試驗、振動試驗、墜落實驗及環境變化檢測實驗均證實該設備經久耐用。Tan E等[40]對該儀器設備的性能，檢測的靈敏度等進行了進一步的驗證。2014年，LGC法醫刑偵科學協會成功研發的ParaDNA Screening快速檢驗系統可在75 min內同時實現對4個樣本的DNA檢測。

表 2商業化全集成DNA分析儀的比較

表選項

6 結束語

綜上，縮短對樣本DNA提取，擴增，純化，電泳檢測中任意環節所消耗的時間均可實現不同程度的法醫DNA的快速檢驗。國內外成熟的方法是使用商品化的提取試劑，快速試劑，或是通過將快速試劑與性能好的快速擴增設備，電泳設備相結合來實現。但是本文認為直接PCR會因為樣本中各種潛在的未知抑制物影響酶的活性，缺乏定量步驟會影響DNA的分型結果，所以使用商業化直擴試劑盒時，要嚴格按照試劑盒所規定的樣本量進行實驗。目前DNA-STR快速檢驗主要適用于常規檢材，但對于一些疑難檢材，混合樣品，以及高度降解的檢材的使用仍然是個嚴峻的挑戰，但是要明確：快速檢驗的目的主要是協助公檢法處理一些棘手和特殊的案件，如處理案件性質惡劣但必需在極其有限時間需要得到分型結果。雖然國外商業化的3種便攜式的全自動快速檢驗儀器已經上市，但普遍存在的問題是檢測成本過高，并且不能自主選擇樣本數，國內普及困難。全集成微流控芯片技術是目前快速檢驗研究的核心，即使芯片的適用具有一定的樣本選擇性，并且芯片結構復雜，成本高，但是國內的研究面臨的主要瓶頸是如何開發配套的軟件來分析自制的微芯片的電泳結果。法醫DNA快速檢驗需從檢測樣本數目的自主選擇、再檢測樣本能力以及疑難，混合樣本的角度出發，研制出我國國產的便攜式全自動快速檢測儀器，并實現推廣普及。

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