DNA抽提指南(TRIZOL)

按照RNA 分離操作方案在完全移去水樣層后，勻漿中的DNA 存在于中間層和苯酚層中也可以被分離出來。在沉淀和多次洗脫后，DNA 溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL試劑從組織和培養細胞中完全回收的DNA 可以用來做樣品中DNA 含量的測定。同時抽提的基因組DNA 可以用于對Northern analysis的結果進行標準化，因為DNA 變異程度比總RNA 或組織重量要小。[由于來源的不同，所得到的DNA 沉淀在進一步應用前可能需要額外的純化步驟（例如苯酚抽提等等）。]

實驗所需但試劑未提供的物品：

* 酒精

* 0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制）

* 75%酒精

8 mM NaOH

如無例外，以下操作均應在15―30℃下完成。

1.DNA 的沉淀

移除中間層上殘余的水樣層，用酒精從中間層和苯酚層中沉淀DNA 。按最初勻漿化時每1 ml TRIZOL加0.3 ml的無水乙醇，反復顛倒來混合樣品。然后將樣品置于15―30℃下2―3分鐘，再在2―8℃下以不超過2,000×g的離心力離心5分鐘沉淀DNA 。

小心移除水樣層對抽提的DNA 的質量至關重要。

2.DNA 的洗脫

移除離心后苯酚層中的上清液，如有必要，可以將其保留用于抽提蛋白。用0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制）洗滌DNA 沉淀兩次。按最初勻漿化時每1 ml TRIZOL加1 ml檸檬酸鈉溶液。每次洗滌時洗滌液要和DNA 沉淀在15―30℃下作用30分鐘（期間周期性混勻）再在2―8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。在兩次洗滌完成后，用75%的酒精重懸DNA 沉淀（每1 ml TRIZOL加1.5―2 ml75%酒精），在15―30℃下放置10―20分鐘（期間周期性混勻）然后再在2―8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。

對于較大的DNA 沉淀（> 200 μg）或樣品中含有較多的非DNA 物質需要用0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制）溶液再洗滌一次。

3.DNA 的再溶解

在開口的試管中空氣干燥DNA 5―10分鐘。（不要用離心干燥；它會使得DNA 極難溶解。）用8m M的NaOH溶解DNA ，大致的比例為0.2―0.3 μgDNA /μl。一般來說，每107個細胞或每50―70 mg組織要加300―600 μl的8m M的NaOH。用弱堿再溶解DNA 是高度值得推薦的，因為抽提的DNA 在水或是Tris緩沖液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA 溶于其中后可以很容易用TE緩沖液或HEPES再調整其pH值。在本步驟中，DNA 樣品（尤其是來自組織的樣品）可能含有一些不溶解的膠樣物質（細胞膜碎片等）。以>12,000×g的離心力離心10分鐘來除去那些不溶的物質。將含有DNA 得上清液轉移到一新的試管中。溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在4℃下放置過夜；如果是長期保存，樣品中還應該用HEPES將pH值調到7―8并加入1 Mm的EDTA。H值調整好后，dna可以保存于4℃或-20℃。

DNA 的定量及預期的產量

取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA 樣品，以適當比例和水混合并測量混合液A260值，以雙鏈DNA 的A260值計算DNA 含量。每一A260單位相當于50μg雙鏈DNA /ml。若以細胞數分析其相應的DNA 產量，大致遵循以下比例：每1×106個分別來源于人，大鼠，小鼠的二倍體細胞分別對應于7.1μg，6.5μg，和5.8μgDNA 。

應用：

通過PCR擴增DNA ：

在DNA 再溶于8mM NaOH后，用0.1 M的HEPES將其pH調到8.4。加0.1到1.0μg的DNA 樣品到PCR反應體系中并執行標準的PCR反應。

限制性核酸內切酶酶切反應：

用HEPES將DNA 溶液的pH值調到酶切所要求的范圍。作為另一可選方案，也可以用pH值為7―8的1 mM EDTA透析DNA 樣品。每ug的DNA 加3-5單位的酶。酶切條件按照酶制造商的說明進行，反應時間為3―24小時。在標準的測定中，80―90%的DNA 是可被消化的。

溶于8 mM NaOH中DNA 樣品pH值的調整：

（每1 ml 的8 mM NaOH使用以下數量的0.1 M 或1 M HEPES，游離酸。）

DNA 抽提注意事項：

1.苯酚層和中間層可以在2―8℃下放置過夜。

2.溶于75%酒精中的DNA 可以在2―8℃下放置數月。

3.溶于8 mM NaOH中的DNA 可以在2―8℃下放置過夜，若要長期保存，將其pH值調整到7―8，并調整EDTA的濃度到1 mM。

疑難解答：

DNA 抽提

?每mg組織或1×106培養細胞預期的DNA 產量

1.肝和腎，3―4μg

2.骨骼肌，腦組織，和胎盤，2―3μg

3.培養的人，大鼠，小鼠細胞(1×106)，5―7μg

4.纖維母細胞，5―7μg

?產量低

1.樣品勻漿化或裂解不完全。

2.終DNA 不完全再溶解。

?A260/280比值<1.70

1.在分光光度計測量前用水而不是用TE緩沖液稀釋DNA 樣品。

2.DNA 樣品中的苯酚沒有完全去除。用0.1 M的檸檬酸鈉（用10%酒精配制）再洗滌DNA 沉淀一次。

?DNA 降解

1.從動物身上取下的組織沒有立即處理或冰凍。

2.用于抽提的樣品，或已經抽提的RNA 樣品存放于-5―-20℃，而沒有存放于-60―-70℃。

3.使用了Polytron或其他高速的勻漿器勻漿樣品。

?RNA 污染

1.水樣層沒有完全去除。

2.用0.1 M的檸檬酸鈉（用10%酒精配制）洗滌DNA 沉淀不完全。

?其他的應用方面

在行PCR擴增前調整pH值到8.4。

對用于限制性核酸內切酶消化的DNA ,調整其pH值到所需的范圍，每μg的DNA 加3―5單位的酶，對某些特殊的酶最佳條件下允許的反應時間在3―24小時內。一般而言，80―90% 的DNA 均可以被消化。