DNA斑點雜交方法（一）

斑點雜交（Dot blot）是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

　　（1）DNA斑點雜交：

　　①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

　　②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

　　③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。

　　④將膜烘干，密封保存備用。

　　（2）RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl

　　DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。

　　（3）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。

　　斑點雜交實驗

　　【實驗原理】用地高辛標記的HCV RNA探針檢測HCV RT-PCR產物。

　　【實驗步驟】

　　1. 處理：將尼龍膜浸泡于20×SSC中吸足液體后，夾在兩層濾紙中37℃烘烤20—30 min。（將尼龍膜置入烤箱后立即進行下一步操作）

　　2. 變性：將待測DNA樣品（HCV經RT-PCR擴增產物；HBV的PCR擴增產物作為陰性對照，每組兩種樣品各10μL）置于PCR儀中100℃加熱10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中驟冷5min。

　　（每一排共三組的樣品點在同一張尼龍膜上）

　　【原理】 使DNA樣品變性，即雙鏈DNA→單鏈DNA。

　　3. 點樣：將上述變性后的樣品各2μL點在尼龍膜的毛面上，室溫下風干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

　　【原理】 使樣品中的DNA與膜結合牢固。

　　4. 預雜交：將雜交膜封入雜交袋中（每兩組的膜背靠背封在一個雜交袋中），做好剪角標記（勿過大）。用1000μL加樣器，加入預雜交液（Dig Easy Hyb），每組5mL全部加完，使尼龍膜恰恰漂起即可，若5mL預雜交液不足，可適當補加。除去氣泡，置42℃恒溫搖床上，輕輕振搖30min-60min。

　　【原理】 封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結合位點。

　　5. 雜交液制備：用預雜交液將探針按100ng/mL濃度稀釋，即為雜交液。

　　（已準備好）

　　6. 雜交：剪開雜交袋一個小角，傾去預雜交液，加入雜交液2-3mL，除去氣泡，封口。置50℃恒溫搖床上，輕輕振蕩過夜。

　　7. 洗膜：（1）回收雜交液；

　　（2）室溫下，用2×wash solution洗膜兩次，每次5min；

　　（3）將0.1×wash solution預熱到50℃洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結合的探針，否則會導致過高的本底。

　　8. 封閉：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培養皿中浸泡1分鐘平衡后，轉入30mL BufferⅡ中，室溫作用30-60min。

　　【原理】封閉雜交膜上非特異性的蛋白結合位點。

　　（在此階段末期，準備下一步的抗體稀釋。稀釋方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后輕輕混勻，4℃ 可保存12h。）

　　9. 酶聯抗體結合：將雜交膜封入一個新的雜交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室溫作用30min，經常搖動，使酶聯抗體與地高辛結合。

　　10.洗膜：（1）取出膜，將膜放入含有30mL BufferⅠ的培養皿中，洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結合的酶聯抗體。

　　（2）取出膜，將膜放入含有20mL BufferⅢ的培養皿中平衡2min。

　　11.顯色：（1）將45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，顯色液必需現配現用！

　　（2）在10mL新鮮制備的顯色底物液中靜止避光顯色數小時，常在12h內完成顯色反應。