DNA測序——鳥槍法

"鳥槍法"是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合，將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。

這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。可以說這是利用“溜散彈射擊原理去“命中”某個基因。由于目的基因在整個基因組中太少太小，在相當程度上還得靠“碰運氣”，所以人們稱這個方法為鳥槍法或散彈槍實驗法。

一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝膠電泳進行回收。
 

二、對回收的大片段DNA用物理方法（如超聲波等）進行切斷處理，然后用T4DNAPolymerase對小片段DNA進行末端平滑化。
 

三、進行Agarose電泳，切膠回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一個A堿基。
 

四、把加上A-tail的DNA片段連入T-Vector中，然后轉化，挑選克隆。
 

五、對陽性克隆（含1kbp～2kbpInsert）進行DNA測序。
 

六、對數據進行編輯，最后連成一條大片段的DNA序列。

一、DNA測序量

應該進行的DNA測序量以DNA片段實際長度的6-8倍量進行計算（針對實際片段大小確定測多少倍的覆蓋率），對每個反應的有效測序長度定義為600Bases。

如：對100kbp的DNA片段進行測序時，可以按以下方法進行計算：

6倍測序量＝100 000 Bases x6/600 Bases＝1 000個反應

8倍測序量＝100 000 Bases x8/600 Bases＝1 333個反應

二、結果編輯

按上述所示的DNA測序量要求進行DNA測序，然后對其所有結果進行編輯。此時的測序結果會連接成數個DNA大片段（Contig）。

三、補缺工作

結果編輯工作結束后，會發現在數個DNA大片段（Contig）間的序列沒有測定，此時應該通過primer walking來測序，進行整體DNA序列的補缺工作。