DNA片段的回收實驗

DNA片段

純化試劑盒 異丙醇

離心機 電泳儀 電泳槽 取液器 微量真空裝置 抽濾裝置

一、從瓊脂糖介質中純化DNA片斷

1.  用低熔點或常規熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離，該電泳安常規方法進行，緩沖液為TAE。

2.  在凝膠上，找到所需條帶，然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 （約300毫克）

3.  如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行，如為低融點瓊脂，則安B步驟進行。

A.  將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，加入1毫升純化用樹脂，然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘，或保溫至瓊脂完全溶解。

B.   將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解，然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中，將其混合20秒，但不要振動。

4.  為每一個待回收片斷準備好一個微量柱。 在每個柱的開口處，聯上一針筒，然后將這些柱與針筒的復合體與抽真空設備相連

5.  在柱-針筒復合體中加入樹脂/DNA混合物，打開真空裝置，將樹脂與DNA的混合物抽到微量柱中，斷開真空裝置與柱的連接。

6.  洗柱，加入2毫升80%的異丙醇，打開真空裝置，使這些洗柱液完全流經微量柱。

7.  繼續真空30秒以干燥樹脂，注意此干燥時間不能超過30秒。關閉真空，移去針筒。將微量柱轉移至一1.5毫升微量離心管中。10 000 g 離心2分鐘，以徹底除去殘存的異丙醇。

8.   將微量柱，再轉移至一新的1。5毫升微量離心管中，加入50微升水或TE緩沖液，靜置1分鐘（在頭30秒，DNA仍將吸附于柱上）， 10 000 g 離心20秒，以洗脫DNA片斷，所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應或在-20℃保存。

二、尿素丙烯酰胺變性膠中分離DNA片斷

1.  從變形膠上切下待回收片斷，將其放如一微量離心管中。

2.  加入100微升TE緩沖液，37℃保溫30分鐘以上。

3.  將上清液吸入一新管中，加入1毫升樹脂，振蕩20秒以混勻樹脂與清液。

1.  對于>3 Kb 的片斷在純化回收時，洗脫前，如先將水或TE緩沖液預熱到65-80℃，則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷>3 Kb 時，洗脫液溫度應為65-80℃；待洗脫片斷>20 Kb 時，洗脫液溫度應達80℃。

2.  應用TAE緩沖液，而不應用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結合成難溶復合物，這種復合物使膠難熔解。

3.  在取用純化柱樹脂中的液體前，應將樹脂充分攪勻，如樹脂中出現結晶或結塊，則應將樹脂在25-37℃，溫熱10分鐘，冷卻至30℃使用。樹脂本身不會溶。

4.  在紫外光下觀察切割條帶時，操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應盡量短，因UV會引起DNA變異。