DNA酶切及鑒定

實驗概要

限制酶主要存在原核細胞中。多數來源于細菌，有的來源于藍藻和鏈霉菌，極少數來源于支原體等微生物中，存在原核細胞的限制酶能在特異的識別位點切斷外源DNA，如感染的噬菌體。而宿主細胞內的DNA則因它的一些特異識別位點常常由于其中一個堿基的甲基化被保護起來，從而使此位點不再成為限制酶的底物。限制性內切酶能特異地結合的一段DNA序列被稱為限制性識別序列，其長度一般為4-6個核苷酸，且呈二重對稱，或稱之為回文序列。質粒酶切和線性DNA基因酶切首先要弄清楚它們的基本酶切位點（附圖）。目前許多限制性內切酶的位點已被確定例如：EcoRI切割位點為：5’  G A A T T C 3’ 

3’ C T T A A G 5’

主要試劑

λDNA: 購買或自行提取純化；重組pBS質料或pUC19質粒；EcoRI酶及其酶切緩沖液；購買成品；HindⅢ酶及其酶切緩沖液：購買成品；瓊脂糖(Agarose)：進口或國產的電泳用瓊脂糖均可、雙蒸水或超純去離子水。

實驗步驟

（一）DNA酶切反應

（1）        將清潔干燥并經滅菌的eppendorf編號，用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2  μl，再加入重蒸水使總體積為19 μl，將管內溶液混勻后加入1 μl酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。

（2）       混勻反應體系后，將eppendorf管置于適當的支持物上，37℃水浴保溫2～3小時，使酶切反應完全。

（3）       每管加入2μl 0.1mol/L EDTA（PH8.0），混勻以停止反應(可做可不做)，置于冰箱中保存備用。

（二）DNA電泳分析

取2μl 以上酶切DNA樣品在1%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。

注意事項

1、酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。

　　2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1小時完全降解1mg   lDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。

　　3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。

　　4、觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。

　　5、EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。