【實驗步驟】
1．PCR產物純化
PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。
2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建
反應體系及條件如下：
3．轉化
3.1 將感受態細胞置冰中融解。
3.2 將60μl感受態細胞移至無菌試管內。
3.3 加入用于轉化的DNA 10μl（＜10ng），輕彈管底混勻。
3.4 冰中放置30分鐘。
3.5 42℃放置45~60秒，不要振蕩。
3.6 冰中放置2~3分鐘。
3.7 加入37℃ 預溫好的LB培養基940μl（無抗生素）。
3.8 37℃振蕩培養1小時（160~225 rpm）。
4．篩選及增菌
4.1 取適量涂布瓊脂平板。
4.2 37℃培養過夜。
4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液體培養基中（含50μg/ml Amp）過夜培養（240 rpm）。
4.4 收集細菌，提取質粒。
5．質粒DNA提取
5.1 2ml 菌液以12000rpm離心1分鐘。
5.2 棄上清，沉淀物溶于100μl溶液Ⅰ（1×）中，劇烈振蕩，室溫5分鐘。
5.3 加新配制的溶液Ⅱ200μl，充分混合后冰浴5分鐘。
5.4 加溶液Ⅲ 150μl，混勻冰浴5分鐘。
5.5 12000rpm離心10分鐘,將上清轉移到另一離心管中。
5.6 加900μl（2倍體積）的乙醇，震蕩混合,室溫放置2分鐘，沉淀雙鏈DNA。
5.7 12000rpm離心5分鐘。
5.8 小心吸去上清液,將離心管倒置于一張紙巾上,以使所有液體流出.再將附于管壁的液滴除盡。
5.9 用1ml 70%乙醇洗滌沉淀的雙鏈DNA,按“步驟5.8”所述方法去掉上清,在空氣中使沉淀的DNA干燥10分鐘。
5.10 用50μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸,振蕩,貯存于-20℃。
6．質粒DNA的限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定
6.1 質粒DNA的限制性內切酶酶切
將清潔、干燥、滅菌的Eppendorff管（0.5ml）編號，用微量加樣器按表1所示將各種試劑分別加入每個管內。
加樣后，小心混勻，置于37℃水浴消化過夜，然后65℃ 20分鐘終止酶解反應。各酶切樣品于-20℃貯存備用。
6.2 瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定質粒DNA酶切片段
6.2.1膠板的準備
取有機玻璃內槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機玻璃內槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃內槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
6.2.2 瓊脂糖凝膠的制備
稱取0.6克瓊脂糖，置于錐形瓶內，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到1.2
%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ml），使溴化乙啶終濃度為0.5μg/ml。小心混勻并倒在有機玻璃內槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開，避免產生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預電泳10分鐘。
6.2.3加樣
取適量的酶切樣品，加入6×載樣緩沖液適量（終濃度為1×），用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。
6.2.4電泳
加完樣品后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA帶負電荷，由負極向正極移動。電場強度不高于5V/cm。當溴酚藍染料移動到距離膠板下沿1~2cm處，停止電泳。
6.2.5 觀察和拍照
取出凝膠，在波長為254 nm的紫外燈下觀察凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或采用有機玻璃防護罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。
以上步驟也可以用凝膠自動成像儀處理。
【實驗結果分析】
1．記錄DNA重組的方法。
2．觀察分析經酶切質粒DNA（實驗組）和未經酶切質粒 DNA（對照組）瓊脂糖凝膠電泳結果。