DNA重組技術(RecombinantDNA)實驗原理、用品和步驟（二）
【實驗步驟】 1．PCR產物純化 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。 2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建 反應體系及條件如下： 3．轉化 3.1 將感受態細胞置冰中融解。 3.2 將60μl感受態細胞移至無菌試管內。 3.3 加入用于轉化的DNA 10μl（＜10ng），輕彈管底混勻。 3.4 冰中放置30分鐘。 3.5 42℃放置45~60秒，不要振蕩。 3.6 冰中放置2~3分鐘。 3.7 加入37℃ 預溫好的LB培養基940μl（無抗生素）。 3.8 37℃振蕩培養1小時（160~225 rpm）。 4．篩選及增菌 4.1 取適量涂布瓊脂平板。 4.2 37℃培養過夜。 4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液體培養基中（含50μg/ml Amp）過夜培養（240 rpm）。 4.4 收集......閱讀全文
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（二）
【實驗步驟】 1．PCR產物純化 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。 2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建 反應體系及條件如下： 3．轉化 3.1 將感受態細胞置冰中融解。 3.2 將60μl感受態細胞移至無菌
DNA重組技術(Recombinant－DNA)實驗原理、用品和步驟（一）
【實驗原理】1．DNA重組技術重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟： 1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產物快速克隆至質粒
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的篩選實驗步驟
實驗儀器控溫搖床水浴鍋 冰箱（-20,‐70℃） 超凈工作臺 培養箱 實驗試劑 Amp LB IPTG X-Gal 平皿 玻棒 三角瓶 離心管 移液器 tip 實驗步驟： 20人／班 1平皿／人 挑取可疑的白色菌落，移植于2mL的LB中，250轉/分搖菌、37℃培養過夜。以快
重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（二）
1.1.4接合轉化接合（Conjugation）是指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數
DNA的重組連接實驗原理和步驟
一、實驗目的 用T4DNA連接酶將載體pBR322 EcoR Ⅰ-CIP處理的DNA片段，與目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段連接起來，構建體外重組DNA分子，同時學習幾種DNA連接的方法。 二、實驗原理 重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg
重組DNA的轉化實驗原理和操作步驟
實驗目的制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和
重組質粒(dna－recombinant－plasmid)的連接
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段( ＜10kb) 且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，
重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（一）
1實驗原理DNA重組分子在體外構建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化。對于不同的受體細胞，往往采取不同的轉化戰略。1.1 DNA重組分子的常用轉化方法1.1.1 Ca 2 誘導轉化1970年Mandel和H
DNA重組實驗中常用的技術（二）
DNA的重組 （一）DNA的酶切與連接 （1）酶切反應 同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。 （2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。 （3）15000rpm離心15min，棄上清。 （4）加
DNA重組技術(DNA－Recombination)
一、DNA 的酶切與連接（1）酶切反應：同質粒DNA 的鑒定，只不過是質粒DNA 換為載體DNA 。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體1
載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。載體的構建和選擇應考慮以下
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定2
（1）CaCl2處理以后的轉化: 當細菌處于0℃、二價陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態；此時轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，重組DNA在42℃短時間熱沖擊后吸附在細胞表面，在豐富培養基中生長數小時后，球狀細胞恢復原
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定1
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體2
二、噬菌體載體作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。㈠ λ噬菌體載體野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組的載體3
在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA重組與鑒定3
當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色，見圖7-11 。如果外源DNA插入片段相當短，不破壞β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的閱讀框，有時產生的重組體菌落不呈白色而是呈淺藍色。4
DNA的定量實驗原理和步驟
一、 實驗原理核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環和嘧啶環的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。1 OD260相當于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以
DNA重組技術
連接反應的策略?? 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：────────────────────────────────
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選2
第二節 材料、設備及試劑一、 材料外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。二、 設備恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋
重組質粒（dna－recombinant－plasmid）的連接、轉化及篩選1
第一節 概 述質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定3
2．利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3ˊ-末端 在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3ˊ-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定2
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸
DNA重組（DNA－recombination）技術：DNA序列測定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶： 1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較
PCR擴增DNA（PCR－Amplify－DNA）實驗原理、材料和操作步驟
【實驗原理】聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外 DNA擴增技術，1985年由Mullis等人創立。該技術能在幾小時的實驗操作中，將人為選定的一段DNA擴增幾百萬倍，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應用廣泛等優點，目前已成為分子生物學及基因工程中極為
PCR擴增分離目的DNA片段實驗原理、材料和步驟（二）
三、材料（一）儀器與器皿PRC 擴增儀（PE2400），瓊脂糖凝膠電泳設備，微量取樣器，一次性指形管，凝膠成像儀,玻片（二）試劑與材料1．瓊脂糖凝膠電泳試劑1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0? 0.002mol/L EDTA2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖
DNA重組（DNA－recombination）技術：工具酶
一、限制性內切酶限制性內切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列。（一）命名原則限制性內切酶大多從細菌中發現，根據來源進行命名，限制酶的第一個字母（大寫，斜體）為宿主菌的屬名，第二、第三
DNA重組技術2
?感受態細胞的制備(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞 下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。
DNA重組技術－連接
實驗概要? ? ? ? 體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。實驗原理? ? 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段， ?然后體外使
重組－DNA－技術介紹
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）
重組－DNA－技術簡介
中文名稱重組 DNA 技術英文名稱recombinant DNA technique定 義在體外將兩個或多個不同的DNA片段全部或部分構建成一個DNA分子的方法。應用學科細胞生物學（一級學科），細胞生物學技術（二級學科）