DNA重組技術－連接

實驗概要

        體外連接獲得重組分子，用于轉化受體細胞。

實驗原理

    質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結構簡單，質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段，  然后體外使兩者相連接， 再用所得到重組質粒轉化細菌，即可完成。但在實際工作中，  如何區分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例，可以將載體的自身環化限制在一定程度之下，也可以進一步采取一些特殊的克隆策略，如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化，還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。

 外源DNA片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段   用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端  用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。  由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物，  而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA的濃度，  以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉，  最大限度地抑制質粒DNA的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產生一個帶有兩個缺口的開環分子，在轉入E.  coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端  是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA聚合酶補   平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4  DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG  8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。

         特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配，  也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。

主要試劑

        T4 連接酶、無菌水、PUC/λDNA（酶切產物）。

主要設備

        微量移液槍，Tip、eppendorf管。

實驗步驟

 連接反應　　　

                 PUC  (酶切產物)     5ul

                 λDNA (酶切產物)    5ul

                 T4 ligase                  1ul

                 10x buffer                 1.5 ul

H2O                          2.5 ul

                -------------------------------

Total                    15ul

16℃連接過夜，第二天可用于轉化篩選轉化子。 

注意事項

        進行酶連接反應時，注意保持低溫狀態，因為Ligase酶很容易降解。一般14-16℃,O/N.