DNA的重組連接

目的：

了解T4DNA連接酶的幾種生物學功能及用途；學習在T4DNA連接酶的作用下，載體與目的基因的幾種不同的連接方式以及在標準的連接反應體系中，質粒載體和插入的外源DNA的比率關系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector與PCR產物進行T-A克隆的機理及其應用。

原理：

外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5′-磷酸可生成4個新的磷酸二酯鍵。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鍵。在這種情況下產生的兩個雜交分子帶有2個單鏈切口，當雜交體導入感受態細胞后可被修復。相鄰的5′-磷酸和3′-羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下述反應條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來。DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體DNA，再加作用的底物。如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大（因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。這樣，在DNA濃度低時，質粒DNA重新環化將卓有成就。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接后的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。

一、材料

載體DNA

二、儀器

離心機、離心管、恒溫水浴箱等

三、試劑

10×Buffer、無水乙醇、3mol/LNaAc、75%的乙醇、1×TE溶液、T4連接酶

四、方法

1、酶切反應

對質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。

A、在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl10×Buffer1μl酶1μl混勻，37°C水浴1h以上。

B、取反應物點樣，觀察酶切效果。

C、酶切完全后，70°C5min終止反應。

2、加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/LNaAc混勻，-20°C2h以上。

3、離心15000rpm×15min,棄上清。

4、加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。

5、加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。

6、測定DNA的含量。
7、加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μ1，在12～14°C反應12～16h。

8、連接反應液可置-20°C保存，供轉化用。

提示：

1、設立兩個對照反應：

1）只有質粒載體

2）只有外源DNA片段

如果外源DNA不足，每個反應可用50～100ng質粒DNA，并盡可能多加外源DNA，同時保持連接反應體積不超過10ū1.可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數制造廠商（除NewEnglandBiolabs公司外）現在都用單位（Weiss等，1968）對該酶進行標化。1個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970）或者60個粘端單位（如NewEnglandBiolabs公司所定義）。因此，0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液（1～5單位/μl，可用20mmol/LTris·ClPh7.6)、60mmol/L、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位、ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬體DNA連接酶于-20°C保存3個月可保持穩定。

2、相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下4個條件：

1）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。

2）不存在亞精胺一類的多胺。

3）極高濃度的連接酶（50Weiss單位.Ml）。

4）高濃度的平端。

在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致DNA分子凝聚成聚集體的物質（凝聚體）、如聚乙二醇或氯化六氨合高鈷，可以使如何取得適當濃度的平端DNA的問題迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩個作用：（1）它們可使平端DNA的連接速率加大1～3個數量級，因此可使連接反應在酶和DNA濃度不高的條件下進行。（2）它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律使分子間連接的產物。這樣，即使在有利于自身環化（j:i=10）的DNA濃度下，所有的DNA產物也將是線狀多聚體。

（1）聚乙二醇（PEG8000）:

A：用去離子水配制成的PEG8000儲存液（40%）分裝成小份，冰凍保存，但加入連續反應混合物之前應將其融化并達到室溫。在含15%PEG8000的連接反應混合物中，對連接反應的刺激效應最為顯著。除PEG8000和T4噬菌體DNA連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于0°C混合，然后加適當體積的PEG8000（處于室溫），混勻，加酶后于20°C進行溫育。

B：連接混合物中含有0.5mmol/LATP和5mmol/LMgcl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或Mgcl2度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

C：濃度為15%的PEG8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10～100倍，反應的主產物時串聯的多聯體。

Ⅳ：PEG8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這方面，它于氯化六氨合高鈷有所不同。

（2）氯化六氨合高鈷

Ⅰ：氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存于-20°C，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽濃度為1.0～1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50倍，但只能使粘端連接的效率提高到原來的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

Ⅱ：在單價陽離子（30mmol/LKCL）存在下，它對平端連接仍由一定的刺激作用，但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再使清一色的分子間連接產物，相反，環狀DNA將占盡優勢。

Ⅲ：與PEG8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。