DNA的限制性酶切和瓊脂糖電泳

實驗原理
1、DNA的限制性酶切
限制性內切酶特異性地結合于一段被稱為限制酶識別序列的特殊DNA序列之內或其附近的特異位點上，并在此處切割雙鏈DNA。它可分為3類。I類和III類限制酶在同一蛋白質分子中兼有修飾（甲基化）作用和依賴ATP的限制（切割）活性（雙功能酶），II類修飾-限制系統是由兩種酶分子組成的雙元系統：一種為限制酶，它切割某一特異的核苷酸序列，另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。分子生物學中常用的就是II類。
絕大多數的II類限制酶識別長度為4~8個核苷酸且呈二重對稱的特異序列。EcoRI的識別序列是G↓AATTC，BmHI的識別序列是G↓GATCC，HindIII的識別序列是A↓AGCTT。

限制性內切酶是一類非常昂貴的試劑，使用過程中要仔細利用并有嚴格的計劃。每種限制性內切酶都有特定的反應條件，如特別的pH范圍，緩沖液組分，溫育溫度等，具體的使用也可參考有關的工具書或文獻或產品說明。一般溫度37℃，pH7.5~8.0對大多數酶來講是適合的，但緩沖液的組分則變化很大，典型的組分應有Tris、NaCl、MgCl2，和巰基試劑(如巰基乙醇或二硫蘇糖醇)。
典型的反應體系中包括lμg或更少的DNA和1單位酶以及合適的反應介質。反應總體積通常控制在20和50ul之間，反應時間在1小時，而反應的終止則由EDTA溶液的加入完成，因為它能鰲合核酸酶活性所必需的金屬離子。
2、DNA的瓊脂糖電泳
DNA的電泳有瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳，它們是分離、鑒定和純化DNA片段的標準方法。
DNA的電泳原理與蛋白質的電泳原理基本相同。DNA分子在電場中通過凝膠介質中而泳動，除電荷效應外，凝膠介質還有分子篩效應，與分子大小及構象有關。由于DNA分子或DNA片段的分子量差別，電泳后呈現遷移位置的差異。瓊脂糖凝膠電泳所需樣品量僅0.5~1ug。瓊脂糖凝膠對DNA的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至50kb的DNA。而分離小片段DNA（5~500bp）則需采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，其分辨力極高，能分離相差1bp的片段。
電泳過程中或電泳完畢直接利用低濃度的熒光染料EB（溴化乙啶）進行染色，EB是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發下，發出紅色熒光。即可確定DNA條帶在凝膠中的位置，而且靈敏度相當高，少至1~10ng的DNA條帶即可直接在紫外燈下檢出。

不同濃度瓊脂糖凝膠分離的范圍
試劑：
（1）1 X TAE電泳緩沖液：45mmol/Ltris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0
（2）凝膠加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液。
（3）λ-DNA和提取的DNA
λ-DNA是λ噬菌體的基因組DNA，全長50kb。用HindIII或（和）BamHI酶切得到的片段被廣泛用于DNA電泳的分子量標準。
（4）分子量標準（λ-DNA/HinD III）
（5）限制性內切酶。

操作方法
1、 DNA的限制性酶切
（1） 取1只1.5mL離心管，按下列順序加入：
DNA：
5uL
10 X buffer:
2uL
蒸餾水：
12uL
限制酶：
1uL
（2）輕輕搖勻，置于37℃保溫1小時。
（3）加入4uL加樣緩沖液，搖勻。
（4）取10uL進行電泳
2、 DNA的瓊脂糖凝膠電泳
（1）將電泳槽徹底洗凈。
（2）將電泳槽置于平整的臺面上并調節水平。
（3）用2%瓊脂糖封固膠模邊緣，任其凝固。
（4）配制1X TAE電泳緩沖液。
（5）用1X TAE 電泳緩沖液配制0.8%的瓊脂糖，微波爐加熱使之溶解。
（6）待瓊脂糖溶液冷至60℃時，緩緩倒入膠模，厚約0.5mm。
（7）立即插入梳子，靜待瓊脂糖凝固。
（8）去掉封固的有機玻璃封條，將膠模放進電泳槽。
（9）向電泳槽倒入1X 電泳緩沖液，沒過凝膠5mm。
（10）小心地拔掉梳子。
（11）用20uL的槍吸取DNA溶液，緩緩注入點樣孔。
（12）按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次點樣
（13）接通電源，電泳。
（14）電泳完畢，取出膠模，將膠置入EB染色液中染色0.5小時。
（15）用搓板取出膠，置于紫外燈下觀察。