| 實驗步驟 |
材料與設備
ATP(20 mmol/L;pH7.0)
[y-32P]ATP(5uCi)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸銨 (10mol/L)
乙醇（100% 及 75%;v/v)
酚/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/異戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
NaOAc(3mol/L)
T4 DNA 連接酶（Stratagene)
酚（經 TE 平衡）
異丙醇（2-丙醇）
重蒸水
Sepharose CL-2B(pharmacia Biotech,Inc.)
溴化氰（CNBr)(Aldrich Chemical Co.,C9149-2)
N，N-二甲基甲酰胺
NaOH(5mol/L)
磷酸鉀（lOmmol/L 及 lmol/Lt 均為 pH8.0)
KCl(1mol/L)
CNBr-活化的 Sepharose*.4B(Pharmacia Biotech,Inc.)
HCl(1 mmol/L)
SpeedVec 旋轉濃縮器（Savant Instruments,Inc.)
試劑
T4 多核苷酸激酶緩沖液（10X)
TE
接頭-激酶緩沖液（10x)
乙醇胺-HCl (1mol/L;pH8.0)〔用 HC1 將 1mol/L 乙醇胺 (游離堿) 調至 pH8.0〕
層析柱的儲存緩沖液
(配方，見"試劑的配制"，P.131—138)
操作程序
寡核苷酸的 5'-磷酸化
1）配成下列反應混合物：
DNA(溶于 TE 的每份寡核苷酸為 440ug；即總 DNA880ug）65ul
T4 聚核苷酸激酶緩沖液（10X)10ul
總體積：75ul
2) 互補 DNA 雙鏈變性后再退火：88°C 孵育 2 min，65°C 孵育 10 min,37°C 孵育 10 min，最后室溫解育 5 min。
3) 合并下列溶液：
DNA(由上步得到）75ul
ATP(20 mml/L;pH7.0；含約 5uCi[γ-32P]ATP)15ul
T4 多核苷酸激酶 (100U)10ul
總體積：100ul
4)37°C 孵育 2 h, 加 50ul 10mol/L 乙酸銨及 100ul H20, 使終體積達 250ul。
5)65°C 加熱 15 min, 使激酶失活。
6) 混合物降至室溫。加 750ul 100% 乙醇，顛倒混勻。用微型離心機于室溫下髙速離心 15 min, 沉淀 DNA。
7) 棄上清，加 225ulTE, 震蕩，溶解沉淀 c
8) 加 250u1 1:1 的酚/氯仿，震蕩混合 1 min, 高速離心 5 min, 使兩相分離。
9) 將上層液體轉移至一新管，加 250ul 24:1 氯仿/異戊醇，震蕩混合 1min, 高速離心 5 min, 使兩相分離。
10) 將上層轉移至一新管中，加 25ul 3mol/LNaOAc，震蕩混合。
11) 加 750ul 100% 乙醇，顛倒混勻，高速離心 15 min, 沉淀 DNA。
12) 棄上清，加 800ul 75% 乙醇，震蕩混合，高速離心 5 min。
13) 棄上清，SpeedVac 旋轉濃縮器干燥。
寡核苷酸的連接
1) 取 10ul 10X 接頭-激酶緩沖液加入 65ul 水中，將 DNA 震蕩溶解于此溶液。
2) 加 20ul 20 mmol/L ATP(pH7.0) 及 5ulT4 DNA 連接酶（30Weiss 單位)，得最終反應體積為 100ul。
3) 在室溫下孵育≥2 h。若 AP-1 寡核苷酸的連接反應不進行，可試著將溫度升至 30℃。
注：根據所用寒核苷酸的不同，連接反應的最適溫度可在 4℃ 至 30℃ 之間變化。短的寡核苷酸（≤十五聚體）在較低溫度下（4~15℃) 連接較好，而具有中等程度回文結構的寡核苷酸有自身退火的傾向，最好在較髙的溫度下（15—30℃) 進行連接。
4）用瓊脂糖凝膠電泳監視連接反應的進程 (每道用 0.5ul 連接反應物，連接好的寡核苷酸平均長度一般至少為十一聚體。
注：①5'-磷酸化的寡核苷酸開始時常常不能連接。因此，如果連接反應不發生，DNA
可用 1:1 酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，然后用乙醇沉淀（用 NaOAc 作為鹽)。將 DNA 溶于 225ul TE, 加 25ul
3mol/L NaOAc, 用 750ul 100% 乙辭重新沉淀 n 沉淀物用 75% 乙醇洗滌后，在 SpeedVac
濃縮器中干燥，然后再試著進行連接。②如可能，應將寡核苷酸連接達至少十聚體的長度。然而，如果不能實現有效的連接，用那些連接不好的 DNA
片段來制備 DNA 親和介質也是可行的，因為在許多情況下已發現用單聚的互補寡核苷酸仍能有效地進行親和層析。
偶聯 Sepharose 用 DNA 的制備
用乙酸銨-異丙醇沉淀去除殘留的 ATP, 否則會干擾連接好的 DNA 與 CNBr 活化 Sepharose 的偶聯。
1) 于 100-ul 連接反應物中加入 100ul 酚（已經 TE 平衡，震蕩混合 1 min。室溫下，微型離心機離心 5 min, 將上層轉移至新管。
2) 加 100ul 24:1 酚/異戊醇，震蕩混合 1 min; 室溫下，微型離心機高速離心 5 min; 將上層轉移至新管。
3) 加 33ul 10mol/L 乙酸銨，震蕩混合。
4) 加 133ul 異丙醇（2-丙醇)，顛倒混勻；-20℃, 孵育 20 min。高速離心 15 min, 沉淀 DNA。棄上清。
5) 加 225ul TE。震蕩溶解沉淀，加 25ul 3mol/LNaOAc，震蕩混合；加 750ul100% 乙醇，顛倒混勻；高速離心 15 min，沉淀 DNA; 棄上清。
6) 所得 DNA 用 75% 乙醇洗滌二次，SpeedVac 濃縮器干燥沉淀。
7) 將 DNA 溶于 50 ml 重蒸水中，-20℃ 保存。不要將 DNA 溶于 TE,TE 中的 Tris 緩沖液會干擾偶聯反應。
用溴化氰將 DNA 偶聯于 Sepharose
本項操作包括用溴化氰（CNBr)
活化 Sepharose CL-2B, 然后將連接好的 DNA 偶聯到 CNBr 活化的 Sepharose 上。因 CNBr
有劇毒，故許多研究者喜歡選用下節所述的替代方法，即采用市售的已經 CNBr 活化的 Sepharose, 這樣就不涉及 CNBr 的直接操作。用
CNBr 活化提供了選擇介質的靈活性。我們一般選擇 Sepharose CL-2B，這種介質是 Sepharose 2B
的交聯形式，強度較高。但市售的經 CNBr 活化的介質只有 Sepharose4B。直接使用 CNBr
的另一個優點是制備活化介質所需的成本要低于購買預先活化好的介質。最后，盡管在純化特定序列 DNA 結合蛋白時，兩種方法制備的 DNA
親和介質可能具有同樣的效果，但本節所述的操作方法比下節所給出的方法用得更廣泛些。
1) 于 60-ml 粗燒結玻板漏斗中，用重蒸水充分洗滌 10~15 ml(沉積后的床體 SepharoseCL-2B。洗膠約用 500 ml 水。
2) 將濕的 Sepharose 膠轉移至帶刻度的 25-ml 量筒，量取約 10-m 丨體積的沉積的膠，加水至終體積為 20 mL。將此漿狀的膠轉移至一置于水浴中（平衡至 15℃) 的 150-ml 玻璃燒中，水浴鍋置于通風櫥內的磁力攬拌器上。
3)
在通風櫥內，稱取 1.lgCNBr 置于一 25-ml 錐形瓶中，用石蠟膜封口。最好是 CNBr 量略多于而不是略少于 1.1 g。將
CNBr 溶于 2 ml N,N-二甲基甲酰胺。CNBr 會立即溶解。邊攪拌邊將 CNBr 溶液干 1 分鐘內逐滴加至漿狀 Sepharose
膠中。
4) 立即按如下所述加入 NaOH。在攪拌下，每 10s 加 30ul 5mol/LNaOH 于上述混合物中（在 15 亡下)，凡 10 min, 至所加 NaOH 總體積為 1.8 ml。
5) 立即加入 100 ml 冰冷的水于燒杯中，將混合物傾至一 60-ml 粗燒結玻板漏斗中。此時，極為重要的是不要將膠吸濾成干餅狀。萬一不慎在吸濾時將膠濾成干餅狀，就不要再用這種干的膠，應從步驟 1）重新開始。
6) 用 100 ml 冰冷的水（≤4℃）洗膠 4 次，再用 100 ml 冰冷的 10mol/L 磷酸鉀 (PH8.0) 洗滌 2 次。
7）立即將一半膠（5 ml) 轉移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入約 2 ml 10 mmol/L 磷酸鉀 (pH8.0), 至膠成粘稠的漿狀。
8) 立即加入 DNA(溶于 50ul 水中，總量為 880ug)。室溫下在轉盤上孵育過夜。
9) 將膠轉移至一 60-ml 粗燒結玻板漏斗中，用 100 ml 水洗滌 2 次，再用 100 ml lmol/L 乙醇胺-HC1(PH8.0) 洗滌 1 次。
注；比較最初幾毫升濾液與洗后介質中的放射性水平，估計 DNA 與介質結合的效率。通常. 所有可檢測的放射性只存在于介質。
10) 將膠轉移至一具螺帽的 5-ml 聚丙烯管中，加 1mol/L 乙醇胺-HCl(pH8.O)，至混合物呈平滑的漿狀。室溫下，在轉盤上蜉育 4~6k 此步的目的是使未反應的 CNBr 活化 Sepharose 失活。
11) 用以下溶液洗膠：
10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH8.0)100 ml
1mol/L 磷鉀緩沖液 (pH8.0)100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存緩沖液 100 ml
12) 制備好的膠于 4℃ 下保存（不要冷凍)。該膠在下至少可穩定 1 年。
用 CNBr 活化的 Sepharose 將 DNA 偶聯于 Sepharose 本操作用市售的經 CNBr 活化的 Sepharose 開始，比上節所述的方法更安全、簡便，上節所述方法涉及 CNBr 活化介質的制備。
1) 稱取 2 g 已經 CNBr 活化的 Sepharose4B 膠。
注：1 g 凍千材料可得終體積約 3.5 ml。
2) 于燒結玻板漏斗中，用 400 ml lmml/LHC1 洗滌并溶脹凝膠約 15 min。
3) 膠先用 100 mlH2O 洗滌，再用 100 ml 10 mmol/L 磷酸鉀 (pH8.0) 洗滌。
4) 立即將 5 ml 膠轉移至一具縲帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入約 2 ml 10 mmol/L 磷酸鉀 (pH8.0)，至成粘稠的漿狀。
5) 立即加入 DNA(溶于 50ul H2O 中，總量為 880ul)。室溫下，在轉盤上孵育 5~6 h(如需要，孵育過夜)。
6) 將膠轉移至一 60-ml 粗燒結玻板漏斗中，用 100 mlH20 洗滌 2 次，再用 100 ml 1mol/L 乙醇胺-HC1(pH8.0) 洗滌 1 次。
注：比較最初幾毫升濾液與洗后介質中的放射性水平，估計 DNA 與介質結合的效率。通常，所有可檢出的放射性只存在于介質 a
7）將膠轉移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加 lmol/L 乙醇胺-HCl(pH8.0), 至混合物呈平滑的漿狀。室溫下，在轉盤上孵育 4~6 h。此步的目的是使未反應的 CNBr 活 Sepharose 失活。
8) 用以下溶液洗膠：
10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH8.0) 100 ml
1mol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH8.0) 100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存緩沖液 100 ml
9) 制備好的膠于 4℃ 下保存（不要冷凍)。該膠在下至少可穩定 1 年。
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