本方案介紹在放射性標記的 DNA 片段上確定蛋白質結合位點的作圖方法。本方案使用 DNA 酶 I 切割 DNA, 而在替代方案中是用羥自由基斷裂 DNA。如果希望得到優化足跡法反應的建議，請參見本方案最后部分的疑難解析以及優化 DNA 酶 I 足跡法反應的欄目。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 實驗材料 | 新鮮組織、培養的細胞、來自細胞或組織的蛋白成分 |
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| 試劑、試劑盒 | 細胞勻漿緩沖液細胞重懸緩沖液細胞淋洗緩沖液乙醇Ficoll 400甲酰胺染色液MgCl2 CaCl2 溶液NaClNonidetP-40酚：氯仿磷酸鹽緩沖液聚乙烯醇終止液組織勻漿液組織重懸緩沖液臺盼藍染料DNA 酶 I變性聚丙烯酰胺測序膠poly(dI-dC)測序膠長度標準品32P 末端標記的 DNA |
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| 儀器、耗材 | Beckman SW28 轉頭或類似產品Sorvall Hl000B 轉頭或類似產品沸騰的水浴鍋帶 B 型研杵的 Dounce 勻漿器晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管橡膠棒 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組成請參見附錄 1。貯存液需稀釋到適當濃度。
細胞勻漿緩沖液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mml/LMgCl2
10mmol/LKCl
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的細胞勻漿緩沖液
細胞重懸緩沖液
40 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
0.4mol/LKCl
1 mmol/LDTT
10%(V/V) 甘油
0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟
0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽
緩沖液貯存于 0°C
細胞淋洗緩沖液
40 mml/LTris-Cl(pH7.4)
1 mmol/LEDTA
0.15mol/LNaCl
緩沖液貯存于 0°C。
乙醇
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll 溶解在無菌水中，分裝成 100ul 并凍存在-20°C。
甲酰胺染色液
10 ml 甲酰膠
10 mg 二甲苯青 FF
10 mg 溴酚蘭
貯存于室溫。
MgCl2/CaCl2 溶液
10 mmol/LMgCl2
5 mmoI/LCaCl2
溶液過濾除菌并貯存于室溫。
NaCl(5mol/L)
NonidetP-40(0.05%V/V)
酚：氯仿
不含 Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS)
聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在無菌水中，分裝成 100ul 并凍存在-20°C。
終止液
20 mmol/LEDTA（pH8.0)
1%(m/V)SDS
0.2mol/LNaCl
125ug/ml 酵母 tRNA
組織勻漿液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.6)
25 mmol/LKCl
0.15 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 亞梢胺
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
2mol/L 蔗糖
10%(V/V) 甘油
該緩沖液在使用前需要冰浴預冷。根據需要，步驟 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶抑制劑。
組織重懸緩沖液
5 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mmol/LMgCl2
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
26%(V/V) 甘柚
貯存于 0°C。
臺盼藍染料（0.4%m/V)
取一定量的染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS) 中。室溫貯存。
酶和緩沖液
DNA 酶 I(lmg/ml)
酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）, 分裝成小份并凍存在-20°C。恰好在步驟 3 以前把溶液以 1:100稀釋于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。
凝膠
6% 或 8% 的變性聚丙烯酰胺測序膠（見第 12 章方案 8)
核酸與寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
取一定量 poly(dI-dC) 溶解在無菌水中, 分裝成 lOOul 并凍存在-20°C。加入核酸聚合物是為了減少蛋白與放射性標記 DNA 片段的非特異性結合，結合反應中 poly(dI-dC) 的最佳濃度 (通常為 0~100ug/ml) 需要靠經驗確定。其他可用于減低非特異性結合的核酸包括剪切過的基因組 DNA(例如來自子 E.coli、鮭魚精子或小牛胸腺）、tRNA、剪切后或限制性酶切后的質粒 DNA、poly(dA-dT) 和 poly(dG-dC)。
測序膠長度標準品
通常由靶 DNA 片段進行 Maxam-Gilbert 測序實驗中的（A+G) 反應組成。化學測序的方法請參見第 12 章的方案 7。此外也可以使用雙脫氧終止法測序反應（第 12 章，方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端與 DNA 酶 I 切割得到的 DNA 片段的放射性末端相同。
放射性化合物
32P 末端標記的 DNA[長度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)]
DNA 片段的末端標記可以通過以下方法完成：磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶補平 3'-縮進的末端 (第 9 章方案 10 和 11, 成第 10 章方案 7）；或用末端標記引物進行 PCR 反應（第 8 章方案 1) 后一種方法更為快速，不依賴于限制性酶切位點，并允許 DNA 結合位點位于末端標記有關的多個位置。不管用何種方法作放射性標記，DNA 片段用于 DNA 足跡反應前部需要用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
反應中使用的 DNA 片段長度應該為 200~500bp。感興趣的結合位點至少離放射標記末端 30bp。如果使用更長的 DNA 片段，測序膠的分辨率會變弱。結合位點離末壩太近可能不被 DNA 結合蛋白或 DNA 酶 I 識別。
離心機和轉頭
Beckman SW28 轉頭或類似產品，預冷到 4°C
Sorvall Hl000B 轉頭或類似產品，預冷到 4°C
特殊設備
沸騰的水浴鍋
帶 B 型研杵的 Dounce 勻漿器
晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管
橡膠棒
輔助試劑
本方案步驟 7~10 需要列在第 12 章方案 8、11 和 12 中的試劑
細胞和組織
新鮮組織、培養的細胞、來自細胞或組織的蛋白成分
方法
1. 用下列 3 種方法中的一種制備核提取物。此外，純化細胞蛋白得到的組分可以直接用于步驟 2。
從組織制備核提取物
a. 解剖 10~15 g 組織并剪碎。加入冰冷的組織勻漿緩沖液，使碎組織的體積調整到 30 ml。用帶緊型研杵的 Dounce 勻漿器勻漿，直到鏡檢確定大于 80%~90％ 的細胞已經破碎。
b. 檢測裂解情況是用 10ul 細胞懸液加相同體積 0.4% 臺盼藍染液，在裝有 20 倍物鏡的顯微鏡下觀察溶液。裂解的細胞吸收染液，被染成藍色，而完整的細胞不被染色，仍然是透明的。繼續進行組織勻漿直到大于 80%~90% 的細胞已經破碎。
C. 勻漿物用冰冷的組織勻漿緩沖液稀釋到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管中放入 10 ml 冰冷的組織勻漿緩沖液，取 27 ml 稀釋的勻漿物鋪在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是 24000r/min）在 4°C 離心 40 min。
d. 去掉上清，離心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把離心管放在冰上。
(可選）用剃須刀刀片切掉管子上部 2/3, 把帶有細胞核的余下 1/3 放在冰上。
e. 用 2 ml 冰冷的組織重懸緩沖液重懸細胞核沉淀。精確測量重懸細胞核溶液的體積，加入冰冷的 5mol/LNaCl，使終濃度為 300 mmol/L。輕輕混勻懸浮液，然后冰浴 30 min。
f. 以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是 24000r/min）在 4°C 離心 20 min 回收細胞核。小心地把上清轉移到新鮮管中。上清分裝成 100~200ul 的小份。留下一份用來做蛋白濃度測定。其他的用液氮速凍，并貯存在液氮中。
g. 用 Bradford 法測定上清液的蛋白濃度。
從培養細胞中制備核提取物
a. 從培養瓶、培養血或培養孔中收獲 0.5X108~1X108 細胞。在室溫下以 250 g(用 Sorvall Hl000B 轉頭是1100r/min) 離心收集細胞。用不含 Ca2+的磷酸鹽緩沖液洗細胞若干次。
b. 用 5 倍體積冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的細胞勻漿緩沖液重懸細胞沉淀。冰浴 10 min，然后如前離心收集。
c. 用 3 倍體積冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的細胞勻漿緩沖液重懸細胞沉淀，用帶有緊型研杵的 Dounce 勻漿器擊打 20 次使細胞勻漿。在細胞脹大裂解并釋放出完整細胞核的勻漿過程中，勻漿器要埋在冰里。
d. 在 4°C 以 250 g(用 Sorvall H1000B 轉頭是 1100r/min) 離心收集細胞核，去掉上清，用 1ml 細胞重懸緩沖液重懸細胞核沉淀。精確測量重懸細胞核溶液的體積，加人冰冷的 5 ml/LNaCl, 使終濃度為 300 mmol/L。輕輕混勻懸浮液，然后冰浴 30 min。
e. 以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是 24000r/min) 在 4°C 離心 20 min 回收細胞核。小心地把上清轉移到一個預冷的新鮮管中。上清分裝成 100~200ul 的小份。留下一份用來做蛋白濃度測定。其他的用液氮速凍，并貯存在液氮中。用 Bradford 法測定上淸液的蛋白濃度。
從小量培養細胞中制備核抽提物
本方法適用于轉染有質粒的細胞，這些質粒能表達編碼轉錄因子的 cDNA。
a. 細胞用細胞淋洗緩沖液洗若干次。每個培養皿加入1ml 細胞淋洗緩沖液，用橡膠棒把細胞刮到緩沖液中。
b. 細胞懸液轉移到 1.5 ml 離心管中，室溫下用最大速度離心 2 min 沉淀細胞。
c. 對于原來在每個直徑為 150 mm 的培養皿中培養的細胞，加 300ul 細胞重懸液重懸細胞，然后進行 3 次凍融。
d. 在 4°C 以最大速度離心 5 min 去掉細胞碎片。上清（即細胞裂解物）分裝成小份貯存在-70°C。
2. 在 1.5 ml 離心管中加入：
核提取物或蛋白組分 1~23ul
32P 末端標記的 DNA 1~10fmol
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
H2O 加到 25ul
可選擇加入：
20%Ficoll 400 12ul
或
10% 聚乙烯醇 10ul
在 4°C 大約離心 5s, 使反應液都流到管底。冰浴 10~30 min。
3. 室溫下加入 50ul MgCl2/CaCl2 溶液并輕輕混勻。室溫下放置 1 min。加入 1~8 稀釋的 DNA 酶 I 溶液，輕輕混勻并在室溫下放置 1 min。
4. 加 75ul 終止液終止反應。很快地搖勻后，用相同體積的酚/氯仿抽提反應液。
5. 把液相轉移到新離心管中，用 2.5 倍體積乙醇沉淀核酸。該乙醇溶液在-70°C 放置 15 min, 然后在 4°C 用最大速度離心 10 min 收集沉淀。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀，再次離心，然后在空氣中干燥以去除殘存的乙醇。
6. 加入 5~10ul 甲醛染液，劇烈振蕩使 DNA 沉淀溶解。煮 3~5 min 使 DNA 溶液變性。
7. 準備 6% 或 8% 變性的聚丙烯酰胺測序膠，加樣前進行至少 30 min 的預電泳。
8. 按以下次序加入 DNA 樣品：
序列梯帶
不含核提取物情況下用 DNA 酶 I 消化后的對照 DNA
含有核提取物情況下用 DNA 酶 I 消化后的靶 DNA
含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情況下培養后的靶 DNA
9. 用足夠的恒定功率跑膠，溫度維持在 45~50°C。
使感興趣的序列獲得最佳分辨率的跑膠時間要根據經驗確定。從甲醛凝膠上樣緩沖液中染料的遷移率觀察電泳的進程。
10. 電泳結束后，撬開玻璃板，把膠轉移到一塊厚的雜交紙上。真空干燥凝膠大約 1h, 然后用 X 射線膠片曝光，如果不用增感屏，需要在-20°C 曝光 12~16 h。此外, 干的凝膠也可以用磷屏圖像分析（phosphorimage analysis), 大約 1~3 h。
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