DNA、RNA斑點雜交

實驗概要

將RNA  或DNA 變性后直接點樣于硝酸纖維素膜上，同探針進行雜交，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研究，稱為斑點印跡。與Southern  及Nouthern  印跡法相比，其優點是簡單、迅速，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，特別是對于核酸粗提樣晶的檢測。缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定的假陽性。

主要試劑

 southern、northern雜交試劑、RNA提取試劑

 DNA提取試劑

實驗步驟

RNA點雜交

1）  純化的RNA的點雜交和狹線雜交

安裝印跡裝置

1．切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標上表示方向的記號。用水把膜簡單弄濕，在20×SSC中室溫泡1 h。

2．在膜浸泡期間，先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印跡裝置，再用無菌水洗干凈。

3．把兩片厚濾紙用20×SSC浸濕，再放到真空器頂部。

4．把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

5．加緊夾板，連接真空管。

6．加入10×SSC直至液面沒過尼龍膜，關掉真空，再用10×SSC充滿。

 RNA樣品準備

1．把每個RNA樣品（溶解在10μl水）分別與30μl RNA變性液混合。

2．65℃溫育5 min，然后在冰上冷卻。

3．向每個樣品中加入等體積20×SSC。

4．輕輕向印跡裝置中吸入10×SSC，直到淹沒尼龍膜。

    RNA樣品的印跡和RNA在膜上的固定

1．把所有樣品輕輕加入狹線中，然后輕輕吸干膜。當所有樣品都鋪到膜上后，每個狹線用1 ml 10×SSC洗兩次。

2．當第二次洗膜完成后，繼續輕輕吸干膜。

3．取下膜，用紫外交聯、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。

   固定化RNA的雜交與洗膜

1．把膜放入烤盤或雜交爐中，加入10~20 ml預雜交液68℃溫育2 h。

2．把已變性的放射性標記的探針直接加到預雜交液中。在適當的溫度下繼續溫育12～16 h。

3．雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉移到室溫下裝有100～200 ml、1×SSC（0.1% SDS）的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖10 min。

4．把膜轉移到另一個裝有100～200 ml、預熱到68℃的0.5×SSC（含0.1% SDS）的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖10 min。

5．按步驟17重復洗膜兩次，使總的洗膜次數達到三次。

6．用濾紙吸干膜，在-70℃條件下放射自顯影24～48 h（Kodak XAR-5 或相當的膠片）。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當然，磷光成像儀也可以用來成像。

  2）RNA斑點印跡的制備（詳見《分子醫學技術》106頁）

1．裁一張大小合適的濾膜，用軟鉛筆標記RNA加樣的位置，一個cm的方格即可。

2．以20×SSC浸泡濾膜。

3．在65℃用以下溶液溫育5min，使10～20μg的總RNA變性。

      置冰浴快速冷卻5min，用微量離心管離心片刻以回收液滴，將管置于冰浴。

4．將濾膜鋪在一疊經20×SSC浸泡過的濾紙（如Whatman 3MM）上。

5．在膜上點樣，每孔4μl RNA，待一孔干燥后再加另一孔。

6．將濾膜置濾紙（3MM）上稍微晾干，用20×SSC漂洗片刻。

7．當濾膜仍潮濕時，將濾膜RNA面朝下在紫外線透照儀照射3～5min，使RNA固定于濾膜上，此濾膜已可用于雜交。

DNA點雜交

?        DNA斑點印跡的制備

預備

1．冰浴中以70W左右的超聲波處理基因組DNA 1min，用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，這些片段大小均應為7～10kb。

2．用TE緩沖液將DNA稀釋至0.5μg/μl。

     斑點印跡的制備

1．加熱5μg DNA（在10μl TE緩沖液中）至95℃ 10min，冰浴5min。用微量離心管短暫離心收集液滴，置冰浴。

2．裁一張大小合適的濾膜，用鉛筆在濾膜上畫25px的方格網以標記DNA點樣的位置。

3．濾膜先用蒸餾水稍微浸濕，并用20×SSC使其飽和。將膜放在經20×SSC預飽和過的濾紙（Whatman 3MM）上。

4．以5μl的DNA分裝樣品在濾膜上點樣，待前一個樣品干燥后再點第二個樣品。

5．將濾膜放在一張干燥的濾紙（Whatman 3MM）上稍微晾干，以5×SSC漂洗5min。

6．將DNA固定于膜上，硝酸纖維素膜需置80℃真空烤爐2h。當尼龍膜仍潮濕時，應用Saran包裝膜（或任何類似的塑料薄膜）包裹，將DNA面朝下置紫外透射儀上，紫外線（280mn）照射3～5min，這時的濾膜已可用于雜交。

注意事項

1、點雜交要防止膜的污染。

2、其它同southern，northern。