FISH和PRINS技術

一、熒光原位雜交（FISH）

是一種簡單、敏感、而容易操作的方法，結果迅速，并能在同一標本上檢測多個不同的基因，可應用于細胞培養、染色體分裂像、冰凍切片和石蠟切片。

FISH技術是利用特異的DNA探針，標記了生物素，地高辛、或熒光素，對檢測細胞進行DNA-DNA原位雜交，并用熒光法顯示。

FISH實驗步驟

試劑配制：

（1）變性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸餾水；28 ml 甲酰胺。每次新鮮配制。

（2）雜交后洗滌液： 20×SSC 4 ml；蒸餾水16 ml；甲酰胺20 ml。每次新鮮配制。調節pH前升至室溫。

1.  用硅化玻片，石蠟切片，60℃烤片過夜。二甲苯脫蠟至酒精，斜置切片，空氣中干燥。

2.  蛋白酶處理：

（1）每個染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內，搖動直到酶溶解。

（2） 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。

（3） 2×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1 min。

（4）梯度酒精脫水（-20℃預冷），空氣中干燥。

3.  變性：

（1）每一個立式染色缸配制40 ml 變性溶液；

（2）78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸；

（3）78℃孵育8 min；

（4） 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預冷酒精內，每缸2 min；

（5）空氣干燥。

4.  雜交：

（1）準備探針；

（2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片；

（3）滴10 μl 探針在切片的組織上，加蓋玻片；

（4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12~16 h。

雜交后水洗：

（5）鑷子小心去除蓋玻片；

（6）43℃預熱雜交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；

（7）2×SSC（37℃）洗兩次，每次10 min；

（8）切片放人染色缸的1×PBS內待檢測，勿使切片干燥。

檢測：

（9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本干燥。把切片放入濕盒內，同時處理4張切片。

（10）每張切片使用30~60 μl 羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20 min；

（11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2 min。

擴增：

（12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；

（13）每張切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20 min；

（14）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2 min；

（15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；

（16）每張切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20 min；

（17）1×PBS室溫下洗3次，每次2 min。

5.  細胞核染色：

（1）張切片加10~20 μl DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5 ml；

（2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內可以在顯微鏡下觀察。

二、用引物介導的原位標記（PRINS）

是PCR和熒光原位雜交（FISH）的結合， PRINS是由未標記的序列特異性寡核苷酸探針與固定在細胞內的靶DNA互補序列，在聚合酶的驅動下，帶有標記的脫氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依賴標記，新合成的DNA就能直接的或間接的帶有FITC，用熒光顯微鏡觀察。

PRINS實驗步驟

1.  常規脫蠟浸入0.01 mol/L PBS；

2.  用0.2 mol/L 鹽酸處理5min；

3.  蛋白酶K（25 μg/ml）消化37℃ 15 min；

4.  分別用80%，95%和100%酒精脫水，室溫干片；

5.  加PCR混合液25 μL（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，各加200 μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl，引物250 ng，Taq DNA聚合酶2 U），加蓋片；

6.  94℃變性5 min后置入65℃濕盒中5 min；

7.  用0.1×SSC液，65℃洗5 min；

8.  片于65℃ 10~20 s；用4×SSC-0.1%吐溫20液42℃洗5 min，2次；

9.  經Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封閉30 min；

10.  加地高辛抗體復合物（1：500）室溫下2 h；

11.  BufferⅢ液洗5 min；

12.  用BCIP-NBT顯色1~2 h，在鏡下控制，終止顯色；

13.  用中性紅或核固紅襯染，酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。