GST融合蛋白沉降實驗

細胞裂解液 其中蛋白質 35S 用標記

裂解緩沖液 SDS 聚丙烯酰胺凝膠 探針 GST 蛋白

沸水浴 翻轉祥品旋轉儀 谷胱甘肽瓊脂糖球珠

材料

緩沖液和溶液
將緩沖液稀釋到適當濃度。

裂解緩沖液
20 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
200 mml/L NaCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.5% Nonidet P-40
使用前加入蛋白酶抑制劑達到下述終濃度：2ug/ul 抑肽酶（aprotinin)、1ug/ul 白胃素（leupeptin)、0.7ug/ml 胃酶抑素（pepstatin) 及 25ug/ml 苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)
溶于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中的還原型谷胱甘肽（20 mmol/L)
可選，請見步驟 8。
2xSDS-PAGE 加樣緩沖液

凝膠

SDS 聚丙烯酰胺凝膠
關于 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的詳情請見附錄 8。

專用設備

沸水浴

翻轉祥品旋轉儀

谷胱甘肽瓊脂糖球珠
在裂解緩沖液中制成 50% 懸液。

探針

GST 蛋白

帶有“誘餌”或探針序列的 GST 融合蛋白
按第 15 章方案 1 描述的方法構建。

細胞和組織

細胞裂解液，其中蛋白質 ³⁵S 用標記
根據實驗目的和所需檢測方法，可用非標記的細胞裂解液。進一步的詳情，請見方案介紹。

附加試劑
此方案的步驟 11 需要如附錄 8 列出的蛋白質免疫印跡和染色試劑，這些蛋白質是由 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的。

方法

預清除細胞裂解液

1. 將細胞裂解液與 50ul 的 50% 谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液和 25ug GST 在 4°C 翻轉混合孵育 2 h。需要檢測相互作用的裂解液的量是高度可變的。開始用相當于 1X10⁶~1X10⁷ 個細胞的裂解液。
由于實驗的目的是比較 GSTT 與 GST 融合蛋白，有必要對每個反應制備足夠量的預清除裂解液。試劑有效地混合是成功的關鍵。為達到此目的，反應應在一個合理的體積中進行：一個好的起始值是 500~1000ul。
這種預清除步驟是要從裂解液中去除與 GST 成分或球珠有非特異性相互作用的蛋白質。如果相互作用的檢測主要是用針對候選相互作用蛋白質的抗體，那么用 GST 或谷胱甘肽瓊脂糖球珠做預淸除并不總是必需的。然而，在用 ³⁵S 標記的細胞裂解液用于確定新的蛋白質-蛋白質間相互作用時，這些步驟有助于降低本底。如果是用針對候選相互作用蛋白質的抗體來檢測相互作用，包含兩種對照很重要：GST 加球珠和僅有球珠。
如果相互作用的目的蛋白已知存在于專門的細胞部位. 那么探針應當與對應那種細胞部位的細胞裂解液組分孵育。

2. 在微量離心機上以最大速度在 4°C 離心混合物 2 min。

3. 將上清（就是預清除的細胞裂解液）轉移到新的離心管中。

探測細胞裂解液

4. 設定兩個含等量預清除細胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽瓊脂糖球珠的微量離心管。在一管中加約 10ug GST 蛋白，另一管中加約 10ug 的 GST 融合探針蛋白。兩個反應中加入的探針和對照蛋白質的量應當是等摩爾 (就是說 GST 的終濃度應當與 GST 融合探針蛋白相同）。將離心管在 4°C 翻轉混合孵育 2 h。
重要：如果結合蛋白是通過煮沸而從球珠上去除（步驟 10), 那么引入僅含谷胱甘肽瓊脂糖球珠和細胞裂解液的對照是重要的，它可檢測到與球珠非特異性結合的蛋白質。

5. 在微量離心機上以最大速度離心樣品 2 min。

6. 在新的微量離心管中收集上清。這些樣品可通過步驟 10 中的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

7. 用1ml 冰冷的裂解液洗球珠。在微量離心機上以最大速度離心 1 min。棄去上清。重復洗三次。

8.(可選）加人 50ul 20 mmol/L 的還原型谷胱甘肽（在 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-Cl 中）到球珠中，洗脫 GST 融合蛋白及任何與其結合的蛋白質。在微量離心機上以最大速度離心 2 min。

9. 將球珠（來自步驟 7) 或洗脫蛋白質（來自步驟 8) 與等體積的 2XSDS-PAGE 上樣緩沖液混合。

檢測相互作用蛋白質

10. 將樣品煮沸 4 min 并做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

11. 檢測與 GST 融合蛋白結合的蛋白的方法取決于細胞裂解液是否被 ³⁵S 標記以及實驗的目的。
(1) 如果目的是檢測與融合蛋白結合的所有 ³⁵S 標記的蛋白，就在干膠儀上將膠抽干，并用 X 線膠片曝光進行放射自顯影。
(2) 如果目的是檢測特異性結合的蛋白質，就將蛋白質從 SDS 聚丙烯酰胺凝膠轉移到膜上，進行免疫印跡分析（附錄 8)。
(3) 如果目的是確定與融合蛋白結合的蛋白質的大小和豐度，而這些蛋白質是來自非放射性的裂解液，就用考馬斯亮藍或硝酸銀將膠染色（附錄 8）。