HPLC基礎知識（二）

3．離子交換色譜法　固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。

離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法　又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。

分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。

分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10

mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。

5．排阻色譜法　固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

II．基本概念和理論

一、基本概念和術語

1．色譜圖和峰參數

色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。

基線(base line)——經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。

噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。

色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。

拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。《中國藥典》規定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。

峰底——基線上峰的起點至終點的距離。

峰高(peak height，h)——峰的最高點至峰底的距離。

峰寬(peak width，W)——峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ

半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ

標準偏差(standard deviation，σ)——正態分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h

2．定性參數（保留值）

死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。死體積(dead  volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）

保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。

保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR

調整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0

調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R

3．柱效參數

理論塔板數(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：N＝()2＝16()2＝5.54()2N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。

用半峰寬計算理論塔數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。

N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)。

理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H＝，H有效＝。

4．相平衡參數

分配系數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。

分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數　（或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。

在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質量分配系數。分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。

容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。

選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數或容量因子之比。α＝＝（設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。

要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。

5．分離參數

 分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。

基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數有如下關系：

            R＝××

其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。

從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c.改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，最好為2~5，窄徑柱可更小些。

二、塔板理論

1．塔板理論的基本假設

塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：

1） 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內完全服從分配定律，并很快達到分配平衡。

2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。

3） 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。

4） 在所有塔板上分配系數相等，與組分的量無關。

雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數（峰高h和峰面積A）

根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述：

            C＝e　　或　　C＝e

由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。

由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。

三、速率理論（又稱隨機模型理論）

1．液相色譜速率方程

1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程（Giddings方程）：

            H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f

2．影響柱效的因素

1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。

2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。

3）傳質阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質分子在流動相、靜態流動相和固定相中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。

①流動相傳質阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產生峰展寬。

②靜態流動相傳質阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。

Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。

③固定相傳質阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。

從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時，H最小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。