HPLC應用

一、樣品測定

1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。

3．記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。

4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數HPLC系統采用定量環（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）

5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。

6．儀器的使用：

①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。

②柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。

③安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。

④樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。

⑤測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。

⑥沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統，則應更換水）。

二、方法研究

1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。

2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。

附件：高效液相色譜法（HPLC）復核細則

一、對起草單位的要求：

1．HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據及參考文獻。

2．應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。

3．建立方法時，應考慮下列事項：

①首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比較試驗，其中一根為國產柱。

②流動相首選甲醇-水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為7~8；如為酸性藥物，流動相的pH值應為3~4。

③盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。

④內標物應首選易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。

⑤檢測器首選UV檢測器。

4．采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應首選自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。

5．HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5％）。

二、對復核單位的要求：

1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。

2．當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行最低撿出量試驗。

3．應考慮對同一樣品分析結果的重現程度、方法的可行性，并作出評價。